纳米微球篇——翎因兵器谱“刀枪剑棍戟”

一、纳米微球概况

微球是直径在纳米和微米尺度范围的球形颗粒。球形物体是自然界存在最稳定的物质形态，它是三维几何空间理想的对称体，也是单位体积中所有立体形态中面积最小的。纳米微球作为一种功能性纳米材料，由于其表面高活性，操作快捷方便、生产，已广泛应用于生物科研、生物制药、医疗诊断、环境检测、食品药品安全检测等领域。

图1   纳米微球是未来发展的基石

二、翎因兵器谱

我司以纳米微球粒径控制、表面功能化和规模化生产为核心，致力于研发生产生物活性分子和生物分离材料，也对其中的纳米微球按照古代兵器谱进行一些排序。

2.1 百兵之帅——刀——二氧化硅磁珠（硅基磁珠）

二氧化硅磁珠一般为核壳结构，由磁性内核Fe₃O₄和外层二氧化硅组成，如图2所示。二氧化硅被认为是当今世界最为理想的包被材料，它有着良好的生物相容性及化学稳定性，能够利用硅烷偶联剂很容易进行表面功能基团的调控。二氧化硅磁珠克服了Fe₃O₄纳米颗粒易氧化的问题，化学稳定性好，具有强磁响应性和亲水性，能够减少磁性纳米颗粒间的磁偶极相互作用，且易于表面改性。因此在核酸提取、小量蛋白分离富集（如IP、Co-IP、Pull-down等）等领域普遍使用。

图2   翎因生物二氧化硅磁珠

二氧化硅磁珠最具特色的用途是核酸纯化。其原理为：由于DNA和RNA具有带负电的磷酸盐骨架结构，如下图3，核酸很容易以胍或钠正离子为桥联离子吸附在SiO₂表面。

图3   核酸与二氧化硅的结合

二氧化硅磁珠表面含有不同的基团和性质，均可用来提取核酸。

（1）羟基磁珠

浓度较高的盐溶液和低pH的溶液条件下，核酸可以与SiO₂的表面结合。溶液变为低盐高pH后，核酸脱离，以此洗脱纯化，如图4所示。磁珠提取步骤简单，无需离心，适合大量、快速、高通量提取。同时，降低下游PCR实验的抑制因子（多糖类、酚类），提高后续分子生物学实验效率，减少PCR反应发生假阴性的概率。目前很多知名生物公司都利用羟基二氧化硅磁珠开发了商业化的核酸提取试剂盒。

图4   磁珠法提取核酸示意图

（2）羧基磁珠

高浓度NaCl和PEG溶液中，DNA与羧基磁珠的表面结合，待降低PEG和NaCl浓度，DNA就可以从羧基磁珠表面洗脱分离，这就是羧基磁珠的固相可逆化吸附。羧基磁珠对核酸的吸附作用机理还不完全明了，可能是核酸在低盐低PEG条件下，呈现的状态是随机弯曲的形态，而在高盐高PEG条件下，它会迅速成为一种较为紧密的形态。因此，我们可以理解为松散且弯曲的核酸有着较优的水溶性，很难吸附到羧基磁珠上，相反，紧密形态的核酸则能够很好地吸附到羧基磁珠表面。

（3）氨基磁珠

氨基磁珠一方面含有SiO₂的壳层来吸附核酸，另一方面，作为阳离子表面的氨基极易和核酸结合，进行阳离子交换吸附。文献报道，与市面上销售的试剂盒比较，氨基磁珠开发的试剂盒回收率和吸附量都更胜一筹。而且操作过程中无需使用醇类试剂，对下游实验影响降到最低。

（4）Oligo-dT包被磁珠

表面偶联了寡聚dT的Oligo-dT包被磁珠可以特异性结合mRNA中的PolyA，可以应用于mRNA纯化试剂盒，操作过程快速高效，实验过程无需离心、沉淀。总RNA中提取带有PolyA的信使RNA多用此方法。另外，对于缓冲液进行调整，可以开发与商品化试剂TRIzol相媲美的mRNA提取试剂盒以及All-in-one试剂盒。

图5   Oligo-dT包被磁珠纯化mRNA的原理示意图

2.2 百兵之王——枪——琼脂糖凝胶

图6   琼脂糖分子结构示意图

琼脂糖是由1,3连接的β-D-吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-L吡喃半乳糖残基交替连接形成的直链线性多糖，分子结构如图6所示。很早以前人们就发现琼脂糖在高温下能够溶于水，琼脂糖的热溶液经冷却可以形成水凝胶，图7表示琼脂糖水凝胶形成过程的示意图。在形成凝胶的过程中，两条单独的多糖链在氢键作用下先形成平行的双螺旋，之后这些双螺旋通过氢键和疏水作用聚集形成具有有序结构的纤维束，纤维束之间形成五角形的孔，一般每个五角形孔结构具有10∽10⁴个多糖纤维束。

图7   琼脂糖凝胶的形成过程

琼脂糖凝胶介质是多糖类层析分离介质中应用最广的一种。作为一种天然的多糖材料，琼脂糖微球由于具有多孔性、亲水性、不含带电基团以及多糖链上的羟基在一定的条件下可以偶联上不同的配基等优点，广泛应用于蛋白质、复合大分子、核酸、多糖、质粒以及病毒的分离纯化。琼脂糖微球除了可以作为凝胶过滤介质外，当用不同的配基对琼脂糖微球进行修饰后，还可以得到基于不同分离原理的介质，包括离子交换层析介质、疏水层析介质和亲和层析介质等。目前层析分离中主要应用的琼脂糖微球，如Sepharose 4FF、Sepharose 6FF以及以此为基础偶联不同配基所制备的一系列疏水、亲和、离子交换介质等，其平均粒径均在90μm左右，粒径分布范围一般在45∽165μm之间。

表1   Sepharose和Superose系列型号及性能

我司用于生物分子纯化的琼脂糖凝胶有His标签蛋白琼脂糖凝胶和GST标签蛋白琼脂糖凝胶，用于His标签蛋白和GST标签蛋白的纯化。

图8   His标签蛋白和GST标签蛋白琼脂糖凝胶的结构

2.3 百兵之君——剑——琼脂糖磁珠

琼脂糖磁珠通常是以Fe₃O₄为核、琼脂糖为壳的核/壳结构微球。它兼具了磁珠和琼脂糖凝胶两者的特性，一方面表面的琼脂糖提供丰富的基团和天然的多孔结构，具有天然的分离纯化效果，另一方面可以通过磁性分离来实现高通量的自动化操作。琼脂糖磁珠通常用于蛋白/抗体纯化，也可用于免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down等。

图9   琼脂糖磁珠

2.4 百兵之祖——棍——聚合物磁珠

聚合物磁珠是以Fe₃O₄为核、聚合物为壳的核/壳结构微球，主要有聚苯乙烯磁珠、聚丙烯酸磁珠、聚丙烯酰胺磁珠。该类型的磁珠与二氧化硅磁珠较为相似。不同的是，使用聚合物包裹Fe₃O₄可以制备出粒径更小，比表面积更大的磁珠及粒径更为均一的磁珠。但制备该类型的磁珠通常需要对表面包裹的聚合物进行改性，改性技术的好坏直接影响着磁珠的非特异性吸附的多少，因此不同厂家的磁珠质量可能会出现参差不齐的现象。聚合物磁珠主要应用于体外诊断（IVD），蛋白分离纯化，细胞分离等方面。

图10   聚苯乙烯磁珠

2.5 百兵之魁——戟——葡聚糖磁珠

葡聚糖磁珠是一种表面包覆葡聚糖的超顺磁Fe₃O₄纳米粒子。因葡聚糖磁珠低毒性、生物相容性，生物降解性，衍生性等特点，因此该类型的磁珠主要用于细胞分选，磁共振成像，造影剂等。磁珠分选细胞原理为：利用结合了磁珠的抗体去标记细胞，通过磁场将结合磁珠与未结合磁珠的细胞分离开来。

图11   细胞分选磁珠——葡聚糖磁珠

三、纳米微球的选配

一般而言，在日常小型分离特定蛋白质和蛋白复合物时，以及进行手动和自动化标准IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和Pull-down反应并立即用于后续检测分析时，硅基磁珠或聚合物磁珠是最佳选择。当抗体成本较低并且想要纯化大量目的蛋白用于多种下游分析时，琼脂糖凝胶是最佳选择。而琼脂糖磁珠集合了磁珠和琼脂糖凝胶两者的优势，是未来生物实验的最佳帮手。

磁珠是蛋白纯化实验中的常见工具之一，对比琼脂糖凝胶实验步骤更精简，无需装柱和过柱层析，常用于批量纯化实验中。使用琼脂糖磁珠纯化，我们可以轻松平行处理多种样品的同时，保证产量和纯度。

体外诊断试剂中使用的磁珠主要是聚苯乙烯磁珠，它的粒径更易于控制，均一性和分散性较好，最适合IVD行业。

细胞分选磁珠主要是葡聚糖磁珠，最负盛名的是美天旎细胞分选磁珠，我司的细胞分选磁珠还在研制中，期待未来与大家的见面。

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