敲黑板 — IP（免疫沉淀）实验抗体如何选？

很多生物学实验都需要使用抗体，例如WB、IP、IF等等，不同的实验对于抗体的选择是有差异的，如果抗体选择不合理，实验的结果将很难达到理想效果。那么IP（免疫沉淀）实验如何选择抗体呢？来了解一下吧

一、在IP实验中，抗体需要通过识别抗原的构象表位并与靶蛋白结合沉淀出来，而只能识别线性表位的抗体则无法做到这一点。所以开始IP实验之前，一定要先确定所选抗体适用于IP实验。

以Anti-HA tag Antibody 为例

另外，一般IP和WB在抗体稀释比上有不同，这一点也需要明确。

二、尽量选择已发表高分文献中经常引用的品牌以及货号。

一般文献中报道的品牌货号产品已经过验证，再结合文章中的数据，择优选择。

三、所选抗体与结合蛋白Protein A/G的亲和力弱，无法将抗体与目的蛋白复合物沉淀下来。

由于不同物种的不同蛋白亚型与结合蛋白的亲和力都不相同，选择相应的结合蛋白才能保证实验顺利。可以根据下表来选择与所用抗体亲和力强的结合蛋白：

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如果IP所涉及目的蛋白带有相关标签，如Flag tag、HA tag等。那么实验中，既可以选择IP级别的抗体并配套相关磁珠（Protein A/G Magnetic beads），也可以直接选用相关标签蛋白抗体磁珠，比如Biolinkedin®Anti-Flag Magnetic beads。

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如果目前所涉及抗体实在无法满足IP实验需要，我们也可以考虑利用链霉亲和素-生物素系统（Streptavidin-Biotin System），将目的蛋白生物素化标记，并通过   Streptavidin Magnetic beads对目的蛋白进行免疫沉淀。

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四、Western Blot 55kD以及25kD出现条带。

多出来的两条，其实是IgG的重链和轻链WB实验上样之前，样品一般要煮沸变性并去除Protein A/G beads，缓冲液中的巯基乙醇会将抗体重链和轻链之间的二硫键破坏，使抗体分子变成55kD的重链分子和25kD的轻链分子。

IP实验抗体与后续用于Western Blot实验的抗体来源种属可以选择不同。如果IP抗体是鼠源的，那么后续WB的抗体可以选择兔源的。

五、单多克隆抗体的选择。

一般单克隆抗体特异性强，背景低，亲和力可能会低一点，检测抗原灵敏度可能也会略低一点；多克隆抗体特异性一般稍弱一些，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性条带。抗体是多克隆还是单克隆，一般为了特异性结合会选单克隆，但如果蛋白丰富低或其他条件条带很难跑出来，可以买多克隆。

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