实验小贴士 I 免疫（共）沉淀如何分组

2221

作者：Biolinkedin

免疫沉淀 ( IP ) 是指从细胞/组织/血液混合物中富集纯化其特异性的靶标或抗原。

免疫共沉淀( CoIP ) 指用抗体用于从混合样品中富集纯化其靶抗原及其结合蛋白。在这种情况下，抗原是诱饵蛋白，而其结合蛋白是通过抗体--抗原相互作用共同纯化的相互作用的蛋白。

图片8.jpg

通常利用Co-IP实验可以

（1）测定两种甚至更多种蛋白质是否在体内结合；

（2）鉴定一种特定蛋白质的作用搭档；

（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

因此，如何简洁并有效的设置分组来明确蛋白间是否互作是CO-IP实验的关键因素之一。

一个成功的Co-IP实验，首先得证明靶蛋白A和预测的相互作用的蛋白B存在于蛋白质样品中，所以抽出来的蛋白样品要直接检测一下A和B的存在，这个一般称为Input。

然后要证明IP抗体是不是能拉下来靶蛋白，所以做完IP后要检测一下靶蛋白。我们需要注意，western的一抗未必能作为IP抗体去捕获靶蛋白，因为western检测时，蛋白是变性的状态，空间结构都打开了。很多抗体在制备时使用的是合成的肽段作为抗原，这样的抗体不一定能识别非变性状态下折叠起来的目的蛋白。所以选IP抗体时一定要注意抗体的介绍上提到的应用（类似ChIP, Flow Cyt, ICC/IF, IHC-P, IP, WB等），而且即使购买的抗体说是可以用于IP的，其在不同样品中的效果还是需要实际检测效果。

图片9.jpg

如果靶蛋白A没有检测到，那么可能有如下几种原因：

要么IP抗体有问题，这个就要换不同的抗体试了，要么beads没有结合上IP抗体，这个倒是可以通过WB来检测是否包被好。一般常用的抗体大部分是鼠源或者兔源，WB时候通过重链/轻链即可判定beads是否偶联上抗体。也有可能是蛋白A表达水平过低，这种情况可以加大样品量。

如果内源性 Co-IP，Input也没有检测出来，这种情况可能是样品本身靶蛋白含量太低或者蛋白提取没有做好，当然，抗体原因也不容忽视。所以我们一般情况可以先尝试做过表达的Co-IP。

IP后A、B蛋白都能检测到，固然是值得高兴的，但是这结果是不是假阳性呢？还得做个阴性对照，目前文献中常提到有几种方法：

（1）只加入beads不加入IP抗体

（2）加入一种不相干的蛋白的抗体作为IP抗体

（3）加入正常IgG作为IP抗体

（4）使用不表达靶蛋白A但表达B的蛋白样品做对照。

另外，CO-IP（免疫共沉淀）一般分为内源性和外源性，我们可以简单理解为内源性CO-IP是检测细胞本身含有的蛋白A和蛋白B互作有无；外源性CO-IP是将蛋白A和蛋白B在细胞内过表达后，再检测二者互作有无。

对于内源性Co-IP实验，如果出现阴性结果，也有可能是蛋白在细胞内表达过低导致，这种情况也可以先做过表达Co-IP作为对照。

只有设置了正确的对照，出来的结果才是可以被合理解释的，也是被认可的。

首先，我们了解相关名称

IB：即immunoblotting（免疫印迹）也就是常规的WesternBlotting，用于检测目的蛋白。

IP：即immunoprecipitation（免疫沉淀）这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。

Input：全细胞裂解液，可认为是阳性组。也就是处理完样本得到的细胞样品，在做IP实验之前，需要预留Input，在检测IP的结果同时确认样本中含有蛋白A和蛋白B。

Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗体

IgG：Anti-A的同型对照抗体，即跟Anti-A同种属来源，如Anti-A是鼠源IgG型，则同型对照抗体需要选择Mouse IgG

目前我们常用以下几种分组方式：

1、内源性CO-IP检测

图片1.jpg

上面示意图分为两大部分：IP 部分和 Input 部分。

首先看Input 部分，通过分别检测蛋白A和蛋白B表达水平，我们可以确认：

1组（IgG组）和2组（Anti-A组）中蛋白A、蛋白B均有表达，并且表达量一致，排除了因部分组别部分蛋白表达缺失、不同组蛋白表达量差异化大等原因造成的假阴性或者假阳性。

然后我们再看IP部分：

“IB:A”结果显示我们1组（IgG组）不结合蛋白A ，2组（Anti-A组）可以特异性富集蛋白A。

“IB:B”结果显示我们IgG组没有非特异性结合，Anti-A组通过特异性富集蛋白A进而拉下蛋白B，即提示我们蛋白A和蛋白B可形成复合物，存在互作。

图片4.jpg

IP部分的“IB:A”这一步检测很关键，可以明确的告诉我们蛋白A已经被我们通过免疫沉淀方法成功的特异性识别并富集到了磁珠/凝胶上，也就是说免疫沉淀的实验操作已成功。而下一步能否检测到蛋白B，主要是由两者是否存在互作决定的，当然，蛋白表达量低，需要某种刺激条件等因素也会影响蛋白B能否被检测到.

2、外源性CO-IP检测

图片2.jpg

上图结果同样分为两大部分：IP 部分和 Input 部分。外源性一般我们不需要设置IgG组（阴性对照），可以利用空载等方式设置阴性对照组。

首先看Input 部分，通过分别检测HA和Flag表达水平，我们可以确认：

A-Flag和B-HA过表达后都能被检测到，并且表达量一致，排除了因样品量不均匀、样品组分缺失等原因造成的假阴性或者假阳性。

然后我们再看IP部分，“IB:Flag ”结果显示1、3组通过IP:Flag可以特异性识别Flag标签并富集蛋白A。“IB:HA”结果显示1、2对照两组没有拉下蛋白B，第3组通过特异性富集蛋白A进而捕获蛋白B，即提示我们蛋白A和蛋白B可形成复合物，存在互作。

图片5.jpg

“IP:Flag IB:Flag ”这一步也是为了明确免疫沉淀特异性识别并利用磁珠/凝胶富集蛋白A的实验过程是成功的。

当然我们也有小伙伴选择以下分组方式

图片3.jpg

本实验一共分为两大组：Input部分及IP部分。

其中IP组又分为IgG组（阴性对照组）和实验组，并通过WB去验证蛋白A和B在每一个组里面是否存在。

由Input组得到结论：蛋白A与蛋白B都是存在的，证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题。这也提示：本实验一般是选取同一份细胞样品，提前取出部分做Input,其余均分为两份即IgG组（阴性对照组）和实验组。

我们继续看IP部分：2组（IgG组）结果显示，蛋白A与蛋白B均没有条带，说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来，证明蛋白A和B与IgG没有结合，同时排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性；而实验组蛋白A和B均有条带，表示利用蛋白A的抗体进行免疫沉淀，富集了蛋白A，同时蛋白B也被拉下来，即提示我们蛋白A和蛋白B可形成复合物，存在互作。