【答疑篇】包涵体蛋白你了解吗？

A. 什么是包涵体？

   包涵体是一种不溶的蛋白质形态，往往蛋白在大肠杆菌或其他表达宿主内高水平表达时，由于表达速率过快，部分蛋白部分折叠或错误折叠，会有暴露在外的疏水区与其他结构类似的蛋白形成的聚集物。

B．如何尽量避免形成包涵体？

   1.延缓蛋白表达，可以降低诱导温度或降低IPTG（0.01-0.1mM）并延长诱导时间，或者构建质粒时采用较弱的启动子。

   2.更换标签质粒，比如使用含有GST，TrX,MBP等标签增强蛋白的可溶性。

   3．与分子伴侣共表达

C．包涵体如何溶解和复性？

包涵体溶解常用尿素，盐酸胍等变性剂，同时也加入一些SDS，巯基乙醇，DTT等还原剂。

复性一般采用稀释、透析和柱上复性三种方式。

D．包涵体复性如何进行方案设计？

   1.我们要了解蛋白的氨基酸序列，通过分析了解半胱氨酸/胱氨酸含量，二硫键，脯氨酸的占比情况。

   2.确定变性剂和添加剂种类和比例

   3.确定复性的方式

   4.明确处理量，方便复性一致性。

E.做抗体可以用包涵体吗？

   可以，而且不需要复性，可以直接作为抗原。

F．变性的蛋白可以免疫动物制备单抗或多抗吗？

   可以，其实变性蛋白也属于天然蛋白，还是具有很强的抗原性，一般这种得到的抗体检测变性蛋白是没有问题的，但如果检测天然蛋白，可能类似做免疫沉淀可能会出现假阳性。

G.包涵体复性后蛋白还有活性吗？复性效率如何？

   这个需要根据自身蛋白特性和复性的条件决定的。

H.包涵体复性有哪些关键点？

   包涵体复性遵循低浓度，低温，平衡梯度。我们再复性过程中需要注意以下几点：

1.   复性蛋白浓度控制在0.1-1.0mg/mL,不宜过高，高浓度会容易形成聚集体沉淀，有的蛋白低浓度不稳定，容易变性。

2.   保持4度低温状态。

3.   保持最适pH值 8.0-9.0之间。可防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键。

4.   复性时间控制在24-36h.

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