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免疫沉淀实验,磁珠 or 琼脂糖微球?

免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。


immunoprecipitation.jpg


传统的琼脂糖微球是多孔的,这使得它们具有高的表面积与蛋白质相互接触,并可以容纳大量的液体。在纯化大量蛋白的时候,传统的琼脂糖微球是完美的选择。免疫沉淀(IP)-利用结合在微球上的抗体将溶液中的目标蛋白质拉下来。过去,我们很自然地使用琼脂糖微球,因为这是我们的习惯。但对IP来说,多孔的结构会带来如下问题:

1)抗体被困在孔内,难以洗去,因此需要大量的洗涤来降低背景。

2)免疫沉淀的洗涤是在微量离心管中进行的,液体之间的交换通过移液枪来完成,很容易丢失样品。

3)微球上的抗体与目标蛋白接触的慢,需要长的孵育时间。

4)长的孵育时间及大量的洗涤导致目标蛋白的机械及生物(蛋白酶水解)损失。

所有这些变化意味实验结果可能并不能如我们所愿进行复制。

现在,科学家在IP实验中,更倾向于使用磁珠,而不是琼脂糖微球。因为磁珠能够解决上述的所有问题。磁磁珠不是多孔的,有磁性,这意味着:

1)没有使抗体藏在深处的隐藏表面,所需的洗涤次数减少。

2)微球上的抗体与目标蛋白很快接触,孵育时间减少。

3)少的洗涤次数及快的孵育时间意味着目标蛋白被蛋白酶水解的机会减少。

4)磁力架快速分离沉淀和上清液,从而降低了丢失样品的机会。节约了操作时间,使操作更自动化。

操作中变量的减少使得实验很容易再复制。

比较了磁珠和琼脂糖微球在IP中的应用,你更倾向于选择哪种呢?


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