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由cancer cell（IF：31.7） 一文看免疫沉淀（IP）在蛋白修饰研究中的具体应用926
摘要 选择性自噬中自噬调节蛋白在自噬底物的选择和运输过程中起关键作用，作者以自噬调节蛋白Optineunin (OPTN)为底物，通过酵母双杂交筛选到肿瘤抑制基因 HACE1，进一步验证含有 HECT domain 的HACE1能够与OPTN蛋白 相互作用，促进 OPTN 的泛素化。进而发现泛素化的OPTN 能够被p62的泛素结合结构域识别并结合，从而调节细胞内自噬活性。 亮点 本文研究中基本覆盖了大部分涉及蛋白互作以及蛋白翻译后修饰的研究的相关实验，诸如内源性IP/CO-IP、外源性IP/CO-IP、GST pulldown、原核表达纯化、泛素化检测、IP/质谱、突变体应用，截断体GST pulldown等等。既为读者提供了具体实验应用的方法、适用的场景，也为读者研究蛋白修饰提供了修饰和思路。 正文 首先，作者通过免疫沉淀(IP)检测发现在细胞中内源性OPTN被大量的泛素化修饰。值得注意的是，免疫沉淀(IP)检测是在RIPA缓冲液中进行的，进一步证明该泛素化信号不是由于其UBAN结构域结合泛素化修饰蛋白而是OPTN 蛋白自身被泛化修饰。（见Figure 1 B及Figure S1 B）。此外，作者还分别用自噬抑制剂 BafilomycinA1 和溶酶体抑制剂 Bortezomib (BTZ) 分别处理细胞，并且检测处理后内源性OPTN的蛋白水平变化。结果提示OPTN 通过自噬-溶酶体途径而非泛素-蛋白酶体途径降解。（见Figure S1 A）
基于以上结果，作者进一步以OPTN为靶蛋白通过酵母双杂交方法筛选与其互作的相关蛋白，最后得到肿瘤抑制基因HACE1。（见Figure 1 C、Figure 1 D）
作者又利用免疫共沉淀（CO-IP）分别检测外源性HACE1 和 OPTN、内源性HACE1 和 OPTN均在细胞内存在相互作用。（见Figure 1 E、Figure 1 F） 分别通过大肠杆菌表达系统获得重组蛋白HACE1和 OPTN，通过GST pulldown证明HACE1 和 OPTN存在直接相互作用。此外，通过构建不同的截短体利用GST pulldown实验证明 HACE1 通过 N 端 ankyrin repeats 与 OPTN 蛋白 C 端 411-456aa (HACE1 interaction region HIR) 直接相互作用。（见Figure 1G-J） 再通过免疫荧光实验确认HACE1 和 OPTN在HEK293FT细胞共定位与细胞质中。（见Figure S1 C）
Figure 2. Tumor Suppressor HACE1 Ubiquitylates OPTN with Lys27and Lys48 Ubiquitin Linkages and on Multiple Lys Residues of OPTN, IncludingLys193 通过前一部分的实验我们已验证HACE1 和 OPTN可以特异性识别、结合，那么HACE1 是否可以促进 OPTN泛素化，如何促进OPTN泛素化，这一部分作者做了详细探讨。 首先，通过重建体外泛素化系统，在ATP、E1、E2等帮助下，HACE1 能够催化 OPTN 蛋白泛素化。（见Figure2 A） 通过表达不同的泛素突变体(K6, K11,K27, K29, K33, K48, K63-only)，免疫沉淀（IP:OPTN ），发现OPTN 被K27和K48的泛素链修饰。（见Figure 2 B-C）;而HACE1 knockdown 之后、OPTN 泛素化也相应被抑制，而且OPTN 泛素化可以被 Usp2cc 特异性抑制。（见Figure S2 A-B）作者进而在自噬缺陷的细胞系 ATG7 -/- 中过表达Flag-OPTN 等相关蛋白，通过免疫沉淀（IP:Flag ）证明 K48 泛素化修饰的 OPTN 蛋白是通过自噬溶酶体途径被降解的。（见Figure 2 D）
作者随后通过体外泛素化反应并电泳切胶条送质谱检测。通过分析质谱数据找到 12 个泛素化修饰的位点。（见Figure S2 C-D） 根据质谱分析结果，构建了OPTN不同的突变体通过免疫沉淀（IP ）发现 OPTN 193 位 Lys 突变为 Arg 后，与OPTN WT 相比泛素化修饰水平明显减少，这意味着193 位Lys 位点对于 HACE1 介导的 OPTN 泛素化修饰起着至关重要的作用。（见Figure S2 E-F及Figure 2 F-G）
此前已有文献报道：磷酸化修饰能促进自噬受体OPTN与 LC3结合介导沙门氏菌通过自噬途径被清除。作者利用体外大肠杆菌纯化GST-LC3,OPTN和 OPTNK93R，通过 GST-pulldown 实验证明了 Lys193 位点 的突变不影响OPTN 与 LC3 的结合。（见Figure S2 G-H）
作者相继验证了： 1、HACE1 能够明显的增加 [LC3II]/[LC3 I] 的比例； 2、OPTN 蛋白能调节细胞自噬活性，自身通过自噬途径被降解； 3、HACE1 诱导的自噬需要 OPTN 蛋白介导，HACE1 介导的OPTN 的泛素 化修饰能够促进细胞自噬，增强细胞清除氧化蛋白的能力 由于以上相关实验不涉及，免疫沉淀相关实验，小编就不一一赘述。 在既有研究中作者发现， p62 的参与能促进 HACE1 和 OPTN 对自噬活性的调控，接下来作者再次利用免疫共沉淀（CO-IP）证明了，HACE1,OPTN 和 p62 蛋白会形成一个复合物。（见Figure 4 C-D）
作者再次通过免疫沉淀（IP）证明：1、过表达泛素化位点突变的OPTNK193R后，HACE1, OPTN 和 p62 互作明显降低；2、过表达全长的 p62 能够与HACE1 和泛素化 修饰的 OPTN 有相互作用。（见Figure 5 A-B） 3、p62只能与被HACE1泛素化修饰的OPTN相互作用，而且泛素化修饰的 OPTN也只能与p62全长相互作用。（见Figure 5 C-D） 4、HACE1介导的OPTN的K48的泛素链修饰能够与p62有相互作用，而非K27的泛素链修饰。（见Figure 5 E-G）
最后，作者分别通过克隆形成、裸鼠成瘤、免疫组化等相关实验，在组织、动物模型等分别对之前结论加以验证。 由于以上相关实验不涉及，免疫沉淀相关实验，小编就不一一赘述。
A model depicting how the HACE1-OPTNaxis might suppress tumor through promoting autophagy in vivo 今天的内容分享完啦，大家记得收藏好慢慢学习哦~ 实验相关磁珠产品详情请查阅：www.bio-linkedin.com (翎因生物)
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