磁珠应用一——免疫沉淀（IP）

一、原理及概述

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等固相支持物上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的方法。需要从细胞或组织裂解物中分离用于免疫印迹检测或其他检测技术的蛋白和其他生物分子时，免疫沉淀是最常用的方法之一。

免疫沉淀（IP）是利用抗原抗体特异性反应，从特定混合物中（通常是细胞裂解液或表达上清）中纯化富集目的蛋白的一种方法。传统的IP实验是抗体与目的蛋白结合后，再与蛋白Protein A /G(结合抗体Fc片段)偶联的琼脂糖或磁珠孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物，复合物经过洗涤、洗脱后用于后续下游实验。IP是许多蛋白质相关研究的重要步骤，用于研究蛋白质的存在、相对丰度、蛋白表达的上下调、蛋白稳定性及相互作用等。

二、用于免疫沉淀的磁珠和琼脂糖树脂

由于IP技术是作为柱式亲和色谱层析的改进方法而开发的，其最初在微量离心管中使用少量（10–25 µL）琼脂糖树脂完成。琼脂糖是不同形状和大小（直径50-150 μm）的海绵样结构。必须通过离心从样品和缓冲液中分离树脂：可以沉淀透明树脂并小心移除溶液，或者使用微量离心过滤管保留树脂并收集离心后管中的溶液。这些限制了琼脂糖IP的可扩展化或自动化程度。

磁性微粒（如Bio-Linkedin磁珠）已经大幅取代琼脂糖，成为免疫沉淀和其他微量亲和纯化方法的首选支持物。磁性微粒是球形固体，抗体结合仅限于每个磁珠的表面。虽然磁珠不具有多孔中心以增加结合能力的优势，但它们明显小于琼脂糖微珠（直径0.2-4 μm），可提供足够大的总表面积以满足高容量的抗体结合。

强力磁力架可将磁珠定位到孵育管的侧壁，使其不阻碍细胞裂解物抽吸，避免吸出与磁珠结合的免疫复合物。磁性分离无需离心，从而不会产生离心导致的抗体-抗原结合破坏和目标蛋白损失。这使得从磁珠中手动移液更简单，并且可使用仪器全自动完成磁珠操作程序——甚至可用于96孔微孔板。

三、免疫沉淀磁珠的优势详解

3.1结合能力和得率

由于琼脂糖树脂是多孔（海绵状）的，其具有较大的表面积-体积比，对抗体的结合能力较高。磁珠的外表面光滑无孔。虽然磁珠直径远远小于琼脂糖珠（这有利于提高总表面积），磁珠的理论结合能力要比琼脂糖低。但是，固定在海绵状琼脂糖上的抗体并不总能够与样品中的目标蛋白（通常为大蛋白复合物）结合，并且抗体可能会在洗涤步骤（离心）中流失。相反，结合在磁珠表面的抗体均能与抗原结合，并且抗体很少会在温和的洗涤步骤（磁体）中丢失。因此，尽管磁珠的抗体结合能力低于琼脂糖，但最终的抗原得率通常与琼脂糖相等或比琼脂糖更高。

3.2可重复性和纯度

使用琼脂糖时，难以在不破坏和靠近一些沉淀树脂的前提下完全移除缓冲液。使用磁珠和磁体时，所有磁珠固定在管壁，所以无需碰触磁珠沉淀即可移除缓冲液。此外，琼脂糖通常需要较长的孵育时间（使溶液向内部空间的扩散）和预纯化步骤（控制非目标蛋白的非特异性结合）。由于所有的相互作用均发生在磁珠的外表面，并且磁珠的尺寸更均一，所以磁珠的可重复性和纯度通常高于琼脂糖。磁珠一般不需要预纯化步骤。

3.3简单、快速和自动化

琼脂糖和磁珠之间的上述差异正是目前免疫沉淀优先选择磁珠的原因。由于琼脂糖免疫沉淀需要较长的孵育时间、预纯化步骤和多次离心，所以其需要大量手动操作，总时间为1-1.5小时。相反，一次磁珠免疫沉淀使用只需大约30分钟即可完成。此外，由于磁性分离不需要离心，在处理多个样品时更简单、更快速，更适合自动化。

3.4免疫沉淀磁珠选择总结

使用磁珠进行免疫沉淀（即，当样品体积< 2 mL）。在日常小型分离特定蛋白质和蛋白复合物时，磁珠可实现结合能力/得率、可重复性、纯度和成本节约之间的平衡。当进行手动和自动化标准IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反应并立即用于后续检测分析时，磁珠是最佳选择。