磁珠应用五——磁微粒化学发光

化学发光免疫测定（CLIA）是将抗原与抗体特异性反应与敏感性的化学发光反应相结合而建立的一种免疫检测技术。

（一）原理

化学发光免疫测定（CLIA）属于标记抗体技术的一种，它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测。

（二）特点

特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。

（三）分类

1、从反应原理上，化学发光免疫技术主要分为直接化学发光和酶促反应化学发光。

1.1直接化学发光

化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。直接化学发光速度快、试剂稳定性好，但灵敏度略低于酶促发光。

代表性的发光剂有：吖啶酯、三联吡啶钌。

1.1.1 吖啶酯

在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。

这类化合物的发光为闪光型，加入发光启动试剂后0. 4s 左右发射光强度达到最大，半衰期为0.9s左右。

特点：

①发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。

②吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2 的稀碱性溶液中即能发光。因此应用于化学发光检测具有许多优越性。

优点主要有：

①背景发光低，信噪比高；

②发光反应干扰因素少；

③光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；

④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；

⑤标记物稳定（在2-8 ℃下可保存数月之久）。

1.1.2.三联吡啶钌

三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。

1.2 酶促反应化学发光

是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。酶促化学发光灵敏度高，但速度慢，酶活性容易受外界影响，其代表性的发光物质有鲁米诺及其衍生物、AMPPD。

1.2.1. 鲁米诺及其衍生物（HRP)

激活酶为辣根过氧化物酶（HRP)，鲁米诺体系的发光基本上为闪光型且信号弱。但在使用增强剂的情况下，发光的持续时间可延到30-60min，发光强度至少增加100倍以上。

现通常采用的体系是Luminol/H2O2/HRP体系，即用HRP标记抗原或抗体，以鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物，对碘苯酚或对苯基酚等作增强剂，用NaOH+H2O2作发光启动试剂，化学发光反应2min后，光反射强度达到最高峰；20min后，光强度减少20%。

1.2.2. 异鲁米诺（ABEI）

新产业的化学发光使用的发光剂，使用的是闪光非酶激活技术，加入启动液后测试0.1-3s时间内的发光强度。

1.2.3． AMPPD (AP)

激活酶为碱性磷酸酶（AP）

AMPPD的特性：

(1) 在碱性环境下，AMPPD的非酶解性的水解程度低，即本底低；

(2) 热稳定性好，在pH=7.0的水中，30℃时的分解半衰期为142h；

(3) 发光为辉光型，波长为470nm，在15min时强度达到高峰，15-60min内光信号强度维持一致，变化很小，即使在12h后仍能测定得出正确结果；

(4) 加入增强剂如聚氯苄乙烯苄基二甲基铵(BDMQ)或BSA等，能明显增强AP酶解AMPPD的发光强度，增强因素达100-100000倍。现通常采用的体系是Dioxetane/AP/EnhanceSystem，即用碱性磷酸酶(AP)标记抗原或抗体，用(金钢烷)-1，2-二氧乙烷或其衍生物作发光底物，在发光底物中加入增强剂。使用此系统的有美国DPC公司的Immulite System和BeckmanCoulter公司Automated Immunoassay System等，迈瑞的化学发光所使用的底物基本上属于AMPPD。

2、从固相载体上，一般分为板式分离和磁珠分离

2.1 板式分离技术：

将抗原/抗体包被在微孔板上，反应时，待检物质通过抗原抗体反应结合于包被板上，通过洗涤液数次洗涤，实现结合部分和未结合部分的分离，后加入底物、启动试剂，用光电倍增管检测发出的光信号。此分离技术和酶联免疫分析技术（ELISA）一致,只是将最后的显色剂改为发光剂得以实现，多数手工法检测，及部分半自动仪器使用这种分离技术，由于抗原抗体结合在反应孔中，反应面积有限，所以为达到充分反应，孵育时间一般比较长。常为0.5h~2h。手工法化学发光最常用的发光体系是鲁米诺/H₂O₂/增强剂，规格和ELISA基本一致，为48T/96T。

2.2 磁珠分离技术

超顺磁珠是一种表面带有特定活性基团、大小均匀、球形、具有超顺磁性及保护壳的微粒。超顺磁珠在有外磁场存在时表现出磁力而发生聚集，无磁场时又失去磁力而分散开来。通过一定的方法可将抗原/抗体等活性物质和磁珠表面的活性基团结合而包被于磁珠上面，检测时，将待检物和包被有抗原/抗体的磁珠在一定条件下孵育，通过抗原抗体反应结合，后通过增加外部磁场，磁珠产生磁性而聚集在一起，即可进行洗涤，实现结合部分和未结合部分的分离，最后加入底物、启动试剂，用光电倍增管检测发出的光信号。使用磁珠法分离，由于反应时磁珠均匀分布于整个液体中，反应面积较大，更容易充分反应，故孵育的时间较短。

（四）磁微粒化学发光

磁微粒化学发光免疫分析是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法 。该技术充分利用了磁性分离技术的快速易自动化性，化学发光技术的高灵敏度性，以及免疫分析的特异性，在生物分析领域展现了不可替代的作用。