外泌体专题二——如何提取外泌体？

超速离心法是公认的外泌体分离金标准方法，也是分离包括细菌、病毒、亚细胞结构（subcellular organelles）等的常用方法。超速离心的方法可分为密度梯度离心(density gradient ultracentrifugation)和普通的差异超速离心（differential ultracentrifugation）两大类。它的基本原理是根据颗粒大小、重量和密度等的差异，梯度施加离心力（centrifugal force）实现分离，离心力最高可加到（100 000 and 150 000 g）故称超速离心。总的来说超速离心是广为使用的经典方法，但也存在可能影响外泌体结构而影响后续分析等不足。

（超速离心分离外泌体示意图）

第二类分离技术着眼于外泌体颗粒的大小（Size-based technique），以超滤为代表，也经常用于从体液（血清、尿液、脑脊液等）和培养液中收集外泌体。它的最大优势在于不依赖复杂的设备，且分离过程虽然耗时但操作相对简单。不过相对而言，获得的外泌体纯度可能相对差一点，且超滤过程的剪切力（shear stress）也对外泌体结构可能有一定影响。

（超滤分离示意图）

这一类分离技术的理论基础是外泌体双层膜结构上表达有特征性蛋白(marker proteins)，于是可以借助特定的抗体来捕获外泌体。它的优势包括基于抗原抗体识别的免疫机制，故纯度较高；同时根据不同的表面标记，可以区分不同的亚组，有助于进一步的机制研究。缺点在于样品制备困难、花费高，且产量较低。

（免疫亲和纯化示意图）

沉淀的基本原理是使用聚合物分子结合水分子，以此降低外泌体在培养基、尿液等液体中的溶解度，通常使用聚乙二醇(polyethylene glycols, PEGs)。沉淀法的最大便利在于不需要特定设备，就能获得较多量的外泌体，缺点在于杂质较多。

（沉淀分离示意图）

基于微流控的分离方法是兼顾外泌体物理属性和生物化学属性的新方法，主要步骤包括免疫亲和(immunoaffinity)、过筛(sieving)、多孔结构捕获外泌体(trapping)，仅需少量样本即可。将微流控技术和前面的分离方法联用的话，可以提高产量和纯度，可惜技术门槛较高，有碍大规模使用。

（微流控分离示意图）

以上便是常见的几种获取外泌体的方法，而初步获得了外泌体之后，还需要进一步的纯化、确认等等过程。

参考：

Li Pin,Kaslan Melisa,Lee Sze Han et al. Progress in Exosome Isolation Techniques.[J] .Theranostics, 2017, 7: 789-804.

Yang Dongbin,Zhang Weihong,Zhang Huanyun et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.[J] .Theranostics, 2020, 10: 3684-3707.