获批FDA丨Protein A纯化填料首次被应用于FDA批准的抗体疗法的商业生产中

随着单克隆抗体产品成功走向商业化，各种形式的抗体片段正在成为下一代治疗蛋白的重要类别，其中包括Fab类及Fab融合蛋白。VHH sdAb是从骆驼科动物的重链抗体可变区（VHH）衍生得到的。这些VHH代表一些最小的抗原结合抗体衍生蛋白。因此它们比full-size的mAbs更稳定，可在微生物体中产生，使每克产品可提供更强的靶向结合活动。因缺少Fc区，这些抗体片段无法被多数重组Protein A亲和配基捕获。但Amsphere™A3 Protein A配基对VHH单域抗体表现出高亲和力（图1）。

图1：Amsphere A3和其他四种市售Protein A亲和填料（按基质类型）用于纯化二价VHH（Ablynx™的VHH sdAb X），在保留时间3分钟条件下的DBC比较。进料：从Pichia Pastoris培养物收获的HCCF。层析柱：直径0.5cm；柱床高度5.0cm

与其他四种市售PrA填料相比，Amsphere A3的DBC最高。其中性能最相近的填料的DBC比Amsphere A3低40%，而且由于其采用玻璃基质，碱稳定性较差。图1所示结果是在默认的Protein A亲和纯化条件下（包括在pH值为3的条件下进行VHH洗脱）测得的（表1）。

表1：图1所示DBC值的测定条件

图2显示使用Amsphere A3对VHH进行批量纯化的层析性能，表明洗脱体积小，而且蛋白回收率和HCP清除率高。

图2：使用Amsphere A3进行VHH sdAb纯化的层析图

蓝色：UV280吸光度

棕色：电导率（mS/cm）

紫色：pH值

在GE Healthcare的ÄKTA™ avant 25系统上进行实验。使用第二代毕赤酵母HCP ELISA试剂盒（Cygnus Technologies，货号F640）进行HCP测定

图1所示结果是基于Amsphere A3配基与VHH sdAb间的相互作用测得的，因此进一步研究两者的相互作用很有意义。由于与Herceptin®单抗的Fab区结合已得到证实（未显示数据），我们还研究了与VH结构域结合的机制；评价了VHH与Amsphere A3结合的条件；比较分析了VHH与mAbs的DBC数据；比较了Amsphere A3与其他现有树脂类型在抗体片段捕获方面的应用；最后描述了Amsphere A3可用作捕获填料的抗体片段变体范围。

我们与布鲁塞尔自由大学（VUB）细胞和分子免疫学实验室合作，分析得出了VHH-PrA复合物的晶体结构。图3为晶体结构分析过程中各步骤示意图。

图3：对VHH sdAb与Amsphere Protein A配基单体形成的复合物进行晶体结构分析的各个步骤概览

通过上述过程（图3）分析得出图4所示的晶体结构。两种蛋白结构的分辨率均达到<2Ångstroms，并且在复合物中得到充分界定。左侧可以看到Protein A单体的3个螺旋。右侧可以看到VHH的典型结构，其中具有2个分别包含4条和5条β链的片层。包含5条β链的片层对应于VH中通常与经典抗体中的VL域发生相互作用的一侧。包含4条β链的片层片暴露在溶剂中，不参与抗原识别。3个CDR位于VHH分子顶部的环形区。

VHH的结合位点位于Protein A配基的螺旋2和3中。已确定Protein A中有7个氨基酸在与VHH的相互作用中最为重要。Fc区的结合位点位于螺旋1和2中，而螺旋2中的谷氨酰胺是唯一参与Fc与VHH结合的氨基酸（Graille等，2000）。

Protein A的相互作用位点位于VHH的框架区1和3。这是包含4条β链的片层侧。VHH中有8个氨基酸朝向Protein A结构域，这些氨基酸主要是极性和/或带电残基：Ser17、Arg19、Lys65、Thr69、Ser71、Gln82、Asn84和Ser85。

为验证是否存在类似的Fab结合机制，使用已发布的人Fab片段中VH域晶体结构对本项目中的VHH进行叠加（图5）。很明显，这两个域呈现极好重叠。VHH中与Protein A相互作用的所有氨基酸在VHH和该VH域之间共享。所有这些氨基酸也保留在Herceptin的VH域中（未显示序列比对）。这有力表明VHH和VH域具有相似的结合机制。在经典抗体的VH域中，Protein A结合区不和VL域相互作用，且不参与抗原结合。

表2显示了两种进料的平均运行持续时间和生产率值。这些值包括系统冲洗所需的时间（在步骤之间执行，使用下一步骤的缓冲液冲洗层析系统）。此过程中的每次系统冲洗需要20秒。所得的生产率值是在典型批量捕获过程中使用层析柱和柱床高度为20cm时所得相应值的10倍。

在不同结合条件下对VHH sdAb进行测定。相关层析条件与表1相同。仅改动进料条件，如表2所示。

注意，这些条件包括进料pH值（6.9 - 7.5）、电导率（8.3 - 43.5 mS/cm）和目标浓度（1.7 - 4.2 g/L），在这些条件下均测得了优异的DBC值。

表2：在一系列进料条件下，Amsphere A3纯化VHH sdAb X（源自Ablynx）的DBC结果（*）：HCCF = 源自Ablynx（毕赤酵母上清液）的澄清进料VHH sdAb X。层析柱：直径为0.5 cm，柱床高度为5.0 cm（Repligen的预装柱）

由于与Protein A的相互作用基于带电残基，预测此相互作用依赖于盐。因此，再次检测VHH是否会在高盐浓度下洗脱（表3和图6）。

表3：VHH sdAb X与Amsphere A3结合的电导率依赖性研究方案。（*）：HCCF = 源自Ablynx（毕赤酵母上清液）的澄清进料VHH sdAb X（浓度4.08 g/L）- pH值为6.9和电导率为8.8 mS/cm

图6：Amsphere A3纯化VHH sdAb的色谱图。在使用1M NaCl执行洗涤步骤后，sdAb仍与层析柱结合。蓝色：UV280吸光度；棕色：电导率（mS/cm）；紫色：pH值

在使用1M NaCl执行洗涤步骤后，sdAb仍与层析柱结合。对于通过木瓜蛋白酶消化Herceptin而产生的Fab片段，发现呈盐依赖性结合（未显示数据）。因此，建议采用低电导率条件（< 5.0 mS/cm）对VH结构域相关靶标进行初始结合研究，但可能会探索更高电导率条件。

单价和二价VHH所示的载量值（g/L）约为full-size mAbs的1/2-1/3（图7）。然而full-size IgG的MW（约150 kDa）约是单价VHH（约15 kDa）的10倍。图7中数据表明，mAbs的保留时间为5分钟，而VHH靶标的保留时间仅为1分钟。对于较小的VHH靶标，1分钟和5分钟时的DBC未见显著差异。

与图7等效的摩尔DBC数据（代表与树脂结合的分子数，表示为µmol/L）如图8所示。每个多聚Protein A配基结合的单价VHH约是mAbs的3至4倍。这些结果可能反映了每个Protein A配基与多个靶标的结合存在空间位阻限制。

目前有两大类填料可用于抗体片段捕获。离子交换和混合模式填料根据靶标分子在既定pH值和盐浓度下的表面电荷将其与杂质分离。使用这些填料可获得更高结合载量。然而，与这些填料类型相比，Protein A的优势在于工艺开发时间明显缩短。Protein A层析所需的工艺开发工作更短。此外，由于采用的是亲和步骤，在捕获步骤后即已达到极高纯度，同时产品回收率超过95%。在有限工艺开发相关中，亲和层析有潜力用于平台捕获步骤。

第二类填料是专为结合特定抗体域（如Protein G或Protein L）而生产的亲和填料（Rodrigo等，2015）。与这些填料相比，Amsphere A3具有良好的碱稳定性，可提高运行次数，从而降低每克纯化产品的成本。Amsphere A3还可在较高pH值（例如3 vs 2）下进行靶标洗脱。表4概述了Amsphere A3在不同NaOH浓度下的暴露时间相关的化学稳定性结果。根据所需的CIP和消毒方案，可利用表中的数据计算树脂寿命（循环次数）。其中给出了80%DBC保留率，因该值通常用作确定填料有效寿命的终点。

表4：Amsphere A3的碱稳定性数据。其中显示了在不同NaOH浓度下，当多克隆IgG 4min保留时间时DBC仍为初始值的90%和80%时所经过的暴露时间

图9总结了Amsphere A3相较于其他填料类型在抗体片段初级捕获方面的上述优势。

图9：Amsphere A3相较于其他填料类型在抗体片段初级捕获方面的优势示意图

上述研究为Amsphere A3与VH(H)抗体形式结合的分子基础提供了一些见解。图10总结了Amsphere A3的2种可变区结合靶标。

图10：与Amsphere A3结合的可变区概述

文献反映Protein A与VH的结合仅限于人VH3亚家族的分子，未包括来自任何其他基因家族的示例。在几乎所有情况下，结合的减少或消失可能与所述残基发生突变有关。特别是对于VHH sdAb，与Ablynx NV合作筛选出110种分子，其中99%显示与Amsphere A3 Protein A配基结合。相互作用的残基位于框架区（因此不参与抗原结合）并且与Fab中的VL并不相互作用，基于这一事实，有可能会将非Protein A相互作用性Ab片段诱变成结合剂（Fridy等，2015；Henry等，2016）。

图11显示了适合将Amsphere A3用作捕获填料的各种形式的抗体片段。可分为3大类：VHH单域抗体和包含VH3结构域的结构体（如Fab和scFv）。

图11：不同类型抗体和抗体片段的概述。绿色框指示了适合将Amsphere A3用作捕获填料的各种形式的抗体片段：包含VH3结构域的分子和VHH单域抗体。（原图：Holliger & Hudson，2005）

除用于含Fc的抗体和结构体之外，Protein A填料Amsphere A3还可用于纯化VHH单域抗体等形式的抗体片段、包含VH3结构域的结构体（如Fab）及不同的融合蛋白（如单链可变片段）。这些结合靶标的概述见图12。基于Protein A的填料具有熟知的耐用性、高选择性、可扩展性和监管接受性，因此Amsphere A3可成为一种理想的平台技术，极大限度地缩短DSP开发时间。