Protein A磁珠Protein G磁珠Protein L磁珠Protein A/G磁珠Protein A琼脂糖凝胶Protein G琼脂糖凝胶Protein L琼脂糖凝胶Protein A/G琼脂糖凝胶Anti-HA磁珠Anti-Myc磁珠Anti-DYKDDDDK磁珠(原Flag磁珠)链霉亲和素磁珠Anti-DYKDDDDK琼脂糖凝胶(原Flag凝胶)Anti-GST磁珠Anti-His磁珠Anti-GFP磁珠伴刀豆蛋白A(ConA)磁珠Protein A琼脂糖磁珠Protein G琼脂糖磁珠Protein A/G琼脂糖磁珠免疫沉淀磁珠His蛋白纯化琼脂糖凝胶GST蛋白纯化琼脂糖凝胶His蛋白纯化琼脂糖磁珠GST蛋白纯化琼脂糖磁珠Protein A Plus 琼脂糖磁珠Protein G Plus 琼脂糖磁珠Protein A/G Plus 琼脂糖磁珠蛋白抗体纯化磁珠PCR产物提取磁珠Oligo-dT包被磁珠核酸提取纯化磁珠羟基磁珠氨基磁珠羧基磁珠醛基磁珠NHS磁珠基础磁珠Protein A免疫(共)沉淀试剂盒Protein G免疫(共)沉淀试剂盒经典Protein A/G免疫(共)沉淀试剂盒Anti-HA免疫(共)沉淀试剂盒Anti-Myc免疫(共)沉淀试剂盒Anti-DYKDDDDK免疫(共)沉淀试剂盒Anti-DYKDDDDK免疫(共)沉淀试剂盒(凝胶法)Anti-GST免疫(共)沉淀试剂盒Anti-His免疫(共)沉淀试剂盒Anti-GFP免疫(共)沉淀试剂盒基础免疫(共)沉淀试剂盒His Pull-down试剂盒GST Pull-down试剂盒分子互作试剂盒His标签蛋白纯化试剂盒GST标签蛋白纯化试剂盒蛋白纯化试剂盒mRNA纯化试剂盒基础mRNA纯化试剂盒核酸提取纯化试剂盒生物配体快速偶联试剂盒生物偶联试剂盒血浆/血清外泌体提取试剂盒(磁珠法)细胞上清外泌体提取试剂盒(磁珠法)尿液外泌体提取试剂盒(磁珠法)外泌体研究产品双排4孔 1.5mL磁力架双排8孔 1.5mL磁力架双排16孔 1.5mL磁力架双排4孔 15mL磁力架双排4孔 50mL磁力架八联排 0.2mL磁力架(PCR)双排八孔1.5mL磁力架(铝合金款)双排十六孔1.5mL磁力架(铝合金款)96孔PCR板磁力架(铝合金款)96孔酶标板磁力架(铝合金款)手持均质仪配套设备生物偶联技术高通量蛋白纯化外泌体定向改造IVD试剂研发服务磁珠应用外泌体专题纳米抗体神经科学领域新冠相关PROTAC技术翎因动态行业新闻优惠促销产品支持技术支持客户发表文章学习资源企业简介企业文化团队风采生产与质量联系我们
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蛋白纯化篇—标签和标签抗体:小样,以为带个马甲我就不认识你了

作者:JMY

一、亲和标签和标签抗体

20世纪70年代亲和标签技术极大地促进了外源融合蛋白和蛋白质复合体的生产纯化,蛋白或者短肽亲和标签现已作为蛋白研究领域必不可少的工具。亲和标签指的是对特定生物或化学配基具有高特异性的蛋白或短肽,兼具高亲和性、纯化条件温和、纯化步骤简易和适用性广的优势。作为一个无可挑剔的亲和标签需要满足以下几点特质:(1)通用性。在任何表达宿主或系统中表达的融合蛋白均能实现分离和纯化。(2)能够融合在目标分子的任意位置,并且对其正确的折叠不产生影响。(3)可以提高目标蛋白的溶解性,提高蛋白表达量。(4)可以位于目标蛋白的表面,便于检测。

图1   亲和标签系统

目前已开发出的亲和标签按照分子量的差异,将其分成两类:一种是结合小分子配体的蛋白标签,如MBP标签,GST标签、GFP标签等,这些标签的使用可以增加目标蛋白的溶解性,缺点是对于一些应用如结晶或生产抗体等,标签必须加以去除;另一种是识别固定化配体的短肽标签,如HA标签、Myc标签、Flag标签、His标签、Strep-tag II等,这一类标签一般不会干扰目标蛋白的生物活性,对于某些应用,小标签无需去除。短肽标签对于融合蛋白的三级结构和生物活性的影响取决于标签的位置和氨基酸组成。表1中列举了用于分离纯化的常见亲和标签。

表1   用于分离纯化的常用亲和标签



标签抗体是指能够与重组蛋白上的标签(HA、Myc、Flag、His、GST、GFP等)特异性结合的抗体,可通过标签融合蛋白免疫宿主的方式得到。它们可以通过抗原-抗体相互作用的原理,特异性结合对应的标签融合蛋白,应用于检测和纯化各种商品化的表达载体的标签序列,来分析蛋白的表达含量及其功能,主要应用包括免疫(共)沉淀、免疫印迹、流式细胞、免疫荧光检测等。标签抗体已经成为开展基因蛋白表达、信号传导和基因功能化研究的工具,在细胞超微结构、蛋白质相互作用、蛋白定位研究中发挥重要作用。

二、常见的标签类别[1-3]

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HA标签

HA标签是一种基于人流感病毒血凝素(Human influenza hemagglutinin)抗原的蛋白标签,其化学本质为一段来自人流感病毒血凝素98∽106号氨基酸的短氨基酸序列(YPYDVPDYA)。HA标签被广泛用作表达载体中的表位标签,其有利于蛋白质的检测、分离和纯化。许多重组蛋白可以表达HA标签,因为它不会干扰蛋白的生物活性或生物分布。因为市售有多种常用的针对HA标签的单克隆和多克隆抗体,在靶蛋白上添加HA标签有助于快速获得其定位、表达或生物学功能相关信息[4]。HA抗体也可以固定在固相载体如琼脂糖凝胶或琼脂糖磁珠用于蛋白纯化。但是,不建议将HA标签用于来源于凋亡细胞的蛋白,因为HA标签会被Caspases3和7切割,从而导致免疫反应性丧失。

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Myc标签

Myc标签是一个具有11个氨基酸的短肽(序列为:EQKLISEEDL),1985年开发出鼠抗c-Myc抗体9E10并被作为免疫化学试剂用于细胞生物学和蛋白质工程领域中[5]。抗体的11个氨基酸抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别9E10免疫球蛋白。Myc标签可放在C端或N端,已成功应用在Western blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞术,因此可用于监测重组蛋白在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳细胞中的表达情况。Myc标签的蛋白可通过将9E10单克隆抗体偶联到固相介质上如琼脂糖凝胶或琼脂糖磁珠来进行亲和纯化,洗脱是采用低pH洗脱,但低pH往往会降低蛋白质的活力,所以Myc标签系统更广泛地应用于检测而较少用于纯化蛋白。

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Flag标签

Flag标签是M1单克隆抗体识别的亲水八肽(DYKDDDDK),分子量小[6,7]。Flag标签作为一种短肽标签,不会对重组蛋白中的表位与结构域造成遮盖,不会影响重组蛋白的功能。同时,Flag标签具有高亲水性,可定位于重组蛋白的表面,便于重组蛋白的检测。Flag标签纯化系统利用合成的Flag短肽竞争性洗脱重组蛋白,不会对重组蛋白的生物活性造成影响。缺点是Flag短肽的合成成本较高,仅适用于小规模的纯化工作,不适合工业化放大,同时还需要添加额外的操作步骤除去结合在层析介质上的Flag短肽。值得注意的是,Flag标签含有肠激酶结合位点(DDDDK),使用肠激酶把标签切除。将3个Flag标签串联起来的3xFlag标签,在兼具Flag标签优点的同时,具有更高的检测灵敏度,与其他检测体系高20-200倍[8],尤其适合哺乳动物细胞表达系统中目标蛋白表达水平比较低的情况。亲和纯化过程中,融合一个3xFlag标签可以得到一个更为显著的纯化效果,同时能更好地保持小分子蛋白的生物活性。

图2   Flag标签系统

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His标签

His标签通常是由5∽15个组氨酸组成,是目前蛋白高通量纯化中使用最广泛的亲和纯化标签,在多种表达系统融合蛋白的表达纯化工作中都适用[9-11]。由于结合量高、成本低廉、高通用性、纯化条件温和、结合特异性高、多种上样条件可供选择,在变性和非变性条件下均不影响重组蛋白的亲和纯化等特点[12],His标签公认为是重组蛋白分离纯化的第一选择。一般采用金属螯合层析技术实现融合His标签融合蛋白的分离纯化,金属螯合层析是自1970年发展起来的一种高效的分离纯化手段。蛋白质表面的半胱氨酸、组氨酸、色氨酸等能与金属离子发生配位键结合。值得注意的是,并非所有的目标蛋白都适合与His标签融合,采用金属螯合层析的方法实现分离纯化。宿主蛋白中若存在半胱氨酸和组氨酸丰富的结构域,在金属螯合层析过程中会发生杂质蛋白的非特异性识别[13];目标蛋白中如果含有金属离子,通常也不推荐使用金属螯合亲和层析。His标签可以与二价金属离子发生配位键结合,如Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等。我司已开发出多种基于不同基质的亲和层析树脂包括His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶和His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠,间隔臂有IDA和NTA两种(图3),目前在售的是IDA的间隔臂,后续会推出以NTA为间隔臂的His标签蛋白纯化介质。

图3   亚氨基二乙酸(IDA)和次氮基三乙酸(NTA)的结构

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Strep-tagII标签

Strep-tag II标签是与链霉亲和素发生特异性识别的肽段,由8个氨基酸(WSHPQFEK)构成。生物素和链霉亲和素之间有着非常剧烈的非共价作用,二者的解离常数数量级在10-14mol/L左右[14]。Strep-tag II能够融合在目标蛋白的任何位置,不会对目标蛋白的正确折叠造成干扰。同时Strep-tag II在纯化过程中不需要金属离子,不与重金属缓冲液的离子反应,不会发生蛋白质聚集现象,因此适合用在含金属离子的重组蛋白的分离纯化上。以上优点使得Strep-tag II适用于哺乳动物细胞和原核细胞表达系统中多种融合蛋白的表达纯化。在进行重组蛋白序列构建时,可在蛋白质和Strep-tag II之间添加2个氨基酸,确保Strep-tag II充分暴露。将链霉亲和素的氨基酸进行定点突变,得到了与Strep-tagII有着更高亲和力的亲和层析介质Strep-Tactin,在Strep-tagII融合蛋白的亲和纯化中具有更优异的表现,主要体现在高蛋白产量和合适的成本。Strep-tag II亲和纯化系统使用2.5mmol/L的脱硫生物素作为洗脱缓冲液,HABA(4-Hydroxy-azobenzene-2-carboxylic acid)溶液作为Strep-Tactin层析介质的再生缓冲液。也有研究发现,将两个Strep-tag II标签通过一个12个氨基酸组成的铰链串联,便得到一个新标签Strep-tag III,其在哺乳动物细胞表达系统中蛋白复合体的纯化与检测更具优势,大幅提高其检测灵敏度[15]。我司后续会推出Strep-tag II标签蛋白纯化介质来满足更多客户的需求。

图4   Strep-tag II标签

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GST标签

GST(谷胱甘肽S-转移酶)标签由21个氨基酸组成,分子量大小为26kDa,能特异性的与其底物谷胱甘肽结合,广泛应用于融合蛋白表达与分离纯化中[16]。融合有GST标签的目标蛋白可以与带谷胱甘肽配基的亲和介质特异性结合,再用酶将GST标签切除,即可得到单纯的目标蛋白。大量实验数据表明,当外源基因在大肠杆菌中过表达,包涵体的出现几率大大增加,不溶性的聚合体的出现降低了可溶性重组蛋白的产量,加大了后续分离纯化的难度,提高了分离纯化的成本。GST能够快速折叠并具有良好的水溶性,因此GST标签可以在很大程度上增大重组蛋白的溶解性,使重组蛋白可溶表达。GST标签兼具可实现分离纯化、提高目标蛋白的水溶性和蛋白含量、纯化条件温和、亲和树脂价格低廉的优势。除了应用于重组蛋白分离纯化外,GST还可以催化外源性物质结合到谷胱甘肽,可以对诸多环境毒素包括化疗药物、残留的农药、除草剂及致癌物质起到分解解毒作用。

图5   谷胱甘肽(GSH)的结构

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MBP标签

MBP(麦芽糖结合蛋白,maltose binding protein)标签由396个氨基酸组成,分子量大小为40kDa,由大肠杆K12菌中MBP基因编码。1988年,MBP亲和标签首次应用于大肠杆菌重组蛋白的表达纯化,MBP标签与直链淀粉树脂特异性结合,通过竞争性洗脱的方式将重组蛋白洗脱,同时利用位点特异性蛋白酶将MBP标签切除。两个分子伴侣系统Dnak-DnaJ-GrpE和GroEL-GeoES聚集到目标蛋白的附近协助MBP的正确折叠。MBP标签可以减少重组蛋白的降解性,提高可溶性和表达量,作为促使外源蛋白可溶性表达的辅助蛋白而得到广泛的应用[17]。然而,从重组蛋白纯化的角度来说,MBP标签并不是一个完美的纯化标签。一方面由于MBP标签不能全部特异性被亲和树脂吸附,另一方面亲和层析后得到的重组蛋白的纯度不能完全满足要求。为了提高MBP标签与直链淀粉树脂的麦芽糖的结合,通过对MBP标签进行氨基酸突变改造实验,发现在MBP标签与目标蛋白序列添加一个由10个天冬酰胺构成的铰链,能够提高某些重组蛋白与直链淀粉树脂的特异性识别。

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GFP标签

最早出现的绿色荧光蛋白是下村修等人于1962年从维多利亚水母中分离出一种在长紫外光照射时可以发出绿色荧光的蛋白,称为GFP,该蛋白是由238个氨基酸组成的多肽链构成,亚基分子量约为27kDa,野生型绿色荧光蛋白在395nm处有最大光吸收,能够吸收蓝光,当受到紫外线或者钙离子激活时,能够发出绿色荧光,最大发射峰为509nm。GFP荧光蛋白的生色团的形成是没有物种特异性的,是不需要任何外源反应底物的。荧光的产生只需要在含有氧气的环境下,分子内的第67位的Gly的酰胺对第65位Ser上羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基,第66位Tyr的α-2β键脱氢反应之后,导致芳香团与咪唑基结合,GFP分子就形成对羧基苯甲酸唑环酮生色团从而发光[18,19]

图6   绿色荧光蛋白的动物

GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其他酶类报告蛋白无法比拟的。它的优点有:(1)荧光极其稳定;(2)GFP抗光漂白能力比荧光素强,一些弱还原剂并不能够影响荧光性质;(3)细胞自发荧光,荧光的产生不需要任何外源反应底物,对细胞低毒害,可直接用于活细胞测定。但是野生型GFP荧光强度较低,且在37℃不能正确折叠,在一些植物细胞中并不表达,其应用受到了限制。人们就对GFP做出大量的改进,在溶解性、折叠性、温度敏感性、荧光强度、荧光光谱、密码子偏爱性等方面做出了大量的突变体。

GFP或其突变体EGFP等被广泛用于基因表达效率的检测,以及和目的蛋白融合表达用于检测目的蛋白的表达和分布。一般来说,GFP抗体不仅可以检测GFP或其适当的突变体,也可以检测和GFP或其适当的突变体融合表达蛋白的表达、细胞内定位,以及纯化、定性或定量检测GFP融合表达蛋白等。

GFP标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛应用于各种细胞类型,包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等,相应的GFP标签抗体也被广泛应用。

三、亲和标签的组合使用

His6-MBP组合标签

His6-MBP组合标签是目前普遍常用的一种亲和标签组合方式。在此组合中,融合蛋白的形式为“His6-MBP-目标蛋白”,其中His标签用于融合蛋白的亲和纯化,MBP部分能够增大目标蛋白的可溶性,提高蛋白产量,His6-MBP与目的蛋白之间加入一段烟草蚀纹病毒蛋白酶切位点,便于后续的标签去除。

串联亲和纯化

该技术方法主要研究蛋白质之间的相互作用。通过在目标蛋白的一端嵌入一个特殊的蛋白标签(如TAP标签),不破坏目标蛋白的调控序列,经过连续两步的亲和层析获得接近自然生理条件下的特定蛋白质复合体,然后用质谱技术鉴定蛋白质。该技术既吸收了亲和纯化得到高纯度低拷贝数的蛋白质复合体,也继承了免疫共沉淀中运用特异性的标记蛋白与亲和层析柱之间的相互作用,可快速得到获得生理条件下与目的蛋白存在真实作用的蛋白质。

四、BiolinkedinÒ相关产品

针对于目前常用的标签及标签抗体,我司开发了一系列相应产品,有免疫沉淀系列和蛋白纯化系列。如下表2所示。

表2   BiolinkedinÒ相关产品

BiolinkedinÒ今天就分享到这啦,有兴趣的小伙伴可以申请试用或者联系我们销售。

参考文献:

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