Protein A磁珠Protein G磁珠Protein L磁珠Protein A/G磁珠Protein A琼脂糖凝胶Protein G琼脂糖凝胶Protein L琼脂糖凝胶Protein A/G琼脂糖凝胶Anti-HA磁珠Anti-Myc磁珠Anti-DYKDDDDK磁珠(原Flag磁珠)链霉亲和素磁珠Anti-DYKDDDDK琼脂糖凝胶(原Flag凝胶)Anti-GST磁珠Anti-His磁珠Anti-GFP磁珠伴刀豆蛋白A(ConA)磁珠Protein A琼脂糖磁珠Protein G琼脂糖磁珠Protein A/G琼脂糖磁珠免疫沉淀磁珠His蛋白纯化琼脂糖凝胶GST蛋白纯化琼脂糖凝胶His蛋白纯化琼脂糖磁珠GST蛋白纯化琼脂糖磁珠Protein A Plus 琼脂糖磁珠Protein G Plus 琼脂糖磁珠Protein A/G Plus 琼脂糖磁珠蛋白抗体纯化磁珠PCR产物提取磁珠Oligo-dT包被磁珠核酸提取纯化磁珠羟基磁珠氨基磁珠羧基磁珠醛基磁珠NHS磁珠基础磁珠Protein A免疫(共)沉淀试剂盒Protein G免疫(共)沉淀试剂盒经典Protein A/G免疫(共)沉淀试剂盒Anti-HA免疫(共)沉淀试剂盒Anti-Myc免疫(共)沉淀试剂盒Anti-DYKDDDDK免疫(共)沉淀试剂盒Anti-DYKDDDDK免疫(共)沉淀试剂盒(凝胶法)Anti-GST免疫(共)沉淀试剂盒Anti-His免疫(共)沉淀试剂盒Anti-GFP免疫(共)沉淀试剂盒基础免疫(共)沉淀试剂盒His Pull-down试剂盒GST Pull-down试剂盒分子互作试剂盒His标签蛋白纯化试剂盒GST标签蛋白纯化试剂盒蛋白纯化试剂盒mRNA纯化试剂盒基础mRNA纯化试剂盒核酸提取纯化试剂盒生物配体快速偶联试剂盒生物偶联试剂盒血浆/血清外泌体提取试剂盒(磁珠法)细胞上清外泌体提取试剂盒(磁珠法)尿液外泌体提取试剂盒(磁珠法)外泌体研究产品双排4孔 1.5mL磁力架双排8孔 1.5mL磁力架双排16孔 1.5mL磁力架双排4孔 15mL磁力架双排4孔 50mL磁力架八联排 0.2mL磁力架(PCR)双排八孔1.5mL磁力架(铝合金款)双排十六孔1.5mL磁力架(铝合金款)96孔PCR板磁力架(铝合金款)96孔酶标板磁力架(铝合金款)手持均质仪配套设备生物偶联技术高通量蛋白纯化外泌体定向改造IVD试剂研发服务磁珠应用外泌体专题纳米抗体神经科学领域新冠相关PROTAC技术翎因动态行业新闻优惠促销产品支持技术支持客户发表文章学习资源企业简介企业文化团队风采生产与质量联系我们
Lab  on  the Beads

蛋白纯化篇—Flag标签与Flag标签抗体:让我们把flag立起来

作者:JMY


一、Flag标签概述

图1   立个Flag

我们这里所说的Flag和平时大家说的立个flag可不是同一件事,初学者可别弄错了。亲和标签指的是对特定生物或化学配基具有高特异性的蛋白或短肽,兼具高亲和性、纯化条件温和、纯化步骤简易和适用性广的优势。而Flag融合标签作为其中的佼佼者,是专门为蛋白纯化和检测而设计的亲水性短肽,由八个氨基酸组成(Asp-Tyr-Lys-Asp-

Asp-Asp-Asp-Lys),如图2所示。Flag标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛应用于各种细胞类型,包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。而利用相应的Flag标签抗体可对融合蛋白进行检测和纯化,并且能够大大提高目的蛋白的纯化效率。

图2   Flag融合标签的氨基酸序列

1.1 Flag标签的作用原理

作为一种人工设计的融合标签,这八个氨基酸残基并非随意排列,而是与Flag抗原的作用密切相关。Flag序列的第二个氨基酸是酪氨酸(Tyr),属于芳香族氨基酸,是抗原-抗体特异性反应的主要因素。位于N端带负电的天冬氨酸(Asp)可辅助Tyr的抗原性,因为在高极性环境中芳香族氨基酸产生作用的可能性高于在低极性环境中。靠近C端的六个氨基酸(Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)组成一个亲水序列,可能形成高度暴露的三位蛋白质构型,在理论上可使序列达到最大的亲水性,也就大大增强了Flag融合标签的抗原性。

1.2 Flag标签的优势

Flag作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点:

(1)序列短小,只用一条人工合成的寡核苷酸链就可以编码;

(2)结晶条件时Flag融合蛋白的构象与单纯目的蛋白的构象几乎完全相同,通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的性质和功能,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究;

(3)融合有Flag标签的目的蛋白,可以直接通过Flag进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高;

(4)抗Flag的抗体可有效识别Flag标签,这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有Flag的融合蛋白进行检测、鉴定;

(5)Flag融合标签含有一个肠激酶切割位点,肠激酶可以识别该短肽C端的五个氨基酸(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys),通过肠激酶处理除去标签后即可获得天然的非融合蛋白质。

1.3 Flag标签的切除

目前切除亲和标签的方法主要有两种:一种是利用特异性的蛋白酶切除融合标签;二是在融合蛋白中引入蛋白内含肽(或内蛋白子)。引入特异性蛋白酶切位点:肠激酶(enterokinase)、凝血酶、Xa因子、烟草蚀纹病毒(TEV)、genenaseⅠ和3C等蛋白酶,在融合短肽和目的蛋白质之间都具有切割位点。

(1)肠激酶:肠激酶是切除N端标签(特别是融合在蛋白N端的Flag标签)时常用的一种蛋白酶,它可精确识别D-D-D-D-K这5个氨基酸残基所组成的序列,切除效率主要依赖于赖氨酸(K)后的第一个氨基酸。Flag标签(DYKDDDDK)内部就含有一个肠激酶切割位点,酶切后可以获得一种只含4个氨基酸残基的Flag亲和标签。研究人员已经将编码牛肠激酶催化位点的cDNA序列克隆出来并且在哺乳动物细胞和大肠杆菌中得到表达。肠激酶具有活性高、适应pH范围广的特点,且在多种变性剂和清洁剂浓度下均可进行切割,切割后产物不含多余氨基酸。Hosfield等利用不依赖连接的克隆(ligation independentcloning,LIC)方法,引入一个氨基酸残基到Flag标签和目的基因之间,形成-DYKDDDDK-X-R序列(X代表引入的残基,R代表目的基因),并将钙调蛋白(calmodulin)基因引入上述序列作为R,以研究残基X对肠激酶切割效率的影响。实验结果表明:位于切割位点旁的氨基酸侧链较长且体积较小时,切割更有效。当X是 Lys、Ala、Leu、Ile、Phe、Glu、Met、Asp和Asn时,具有较好的切割效率,可达80%以上。但当X为Tyr或Pro时会使切割效率下降到70%以下,这是因为其增加了空间位阻。以上表述对于获得天然蛋白质非常重要。故我们可以用LIC方法,将Flag标签直接连接到目的基因序列上,表达后再利用Flag标签对产物进行纯化,然后使用肠激酶切割去除Flag标签,以得到天然蛋白,并对其性质和功能进行研究。

(2)凝血酶:也是一种应用很广泛的蛋白酶,主要特点是经凝血酶切割后的重组蛋白在切割位点的C端会保留两个氨基酸残基。凝血酶可识别两种类型的氨基酸序列,一是X4-X3-P-R[K]-X1-X2,另一种是X2-R[K]-X1,凝血酶对前一种序列的识别效果较为理想。实验表明,如果设计5个氨基酸残基在切割位点和N端标签之间时,可增加凝血酶的切割活性。

(3)Xa因子:与上述蛋白酶相同,Xa因子也是一种较高效的去除融合标签的工具酶,可特异性识别I-E[D]-G-R-X1序列,并将融合标签从其C末端切除,这种识别在众多蛋白酶中是唯一的,只不过Xa因子的切割需长时间的孵育且效率不高。

二、抗Flag标签单克隆抗体概述及应用

2.1 抗Flag标签单克隆抗体的研究进展

目前共有三种抗Flag标签单克隆抗体被研制出来并投入使用,分别为M1、M2和M5。这三种抗体在使用上特别是和不同抗原结合时有所差异。M1单抗是最早被应用的,其特点是必须在Ca2+的参与下才能和Flag抗原结合,常用于许多N端Flag标签的重组融合蛋白质的鉴定与纯化。氨基酸扫描实验表明,M1单抗的结合主要是前四个氨基酸,并要求具有自由的N末端氨基。也就是说,如果Flag标签融合在蛋白质的C端,或者融合蛋白的N端有Flag标签的前提下还有其他氨基酸残基,M1抗体就无法发挥作用。

为了解决上述情况,抗Flag M2单克隆抗体随之出现,它大大扩展了Flag标签的应用领域。由于M2抗体与抗原的结合不依赖于Ca2+,故螯合剂(如EDTA)就无法作用吸附柱上的抗原-抗体复合物。M2抗体的另一个重要优点是允许Flag序列前存在多余氨基酸残基,可应用于N端Met-Flag和C端Flag融合蛋白质。

与通用型的M2单抗相似,第三种单抗M5的结合也不依赖于Ca2+,并且多用于类似N-Met-Flag-C的序列,对此种融合蛋白的亲和力非常高。因此,M5单抗是用于检测在细胞质表达的Flag融合蛋白质的首选抗体。而M2单抗可以结合到以上提到所有类型的N末端Flag融合蛋白上,因此具有通用性。三种抗体的作用特点比较见下表1。

表1   M1、M2和M5单克隆抗体作用特点比较


2.2 抗Flag标签单克隆抗体的制备与鉴定

(1)Flag标签完全抗原的制备与鉴定:通过碳化亚胺法将Flag标签与载体蛋白偶联上,载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、匙孔血蓝蛋白(KLH),制备得到3种免疫抗原,3种载体蛋白合成得到的抗原互为包被抗原。

(2)Flag标签单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备:使用上述的抗原与佐剂进行动物免疫,后续采用间接ELISA方法检测效价。选择效价最优的进行杂交瘤细胞株的融合,筛选出阳性克隆并进行扩增,最终得到杂交瘤细胞株。

(3)Flag标签单克隆抗体的制备与鉴定:按照Golding的方法生产腹水,并采用正辛酸-硫酸铵的方法纯化腹水,最终得到纯化后的腹水。并对腹水的效价、纯度、单抗亚型和亚类、交叉反应及相对亲和力进行测定,完成Flag标签单克隆抗体的制备与鉴定。

所有具体步骤在文献中都有详细介绍,这里不一一展示。

图3   抗体基本结构

2.3 抗Flag标签单克隆抗体的应用

(1)用于融合蛋白的检测和纯化:虽然许多非亲和标签具有生物学活性,可以用于融合蛋白的检测,但是这些非亲和标签由于表达环境或检测条件的限制可能会影响自身的部分生物学活性。因此抗体依然是分析融合蛋白表达的最重要方法。在抗融合标签的单克隆抗体的参与下,表达产物的蛋白质水平可以方便的通过酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫印迹等方法进行检测。这对未知蛋白的表达更加具有意义。除了用于融合蛋白的检测,抗融合标签抗体的另一主要用途是进行相应融合蛋白的纯化。研究表明,利用抗融合标签抗体进行免疫亲和层析的纯化效率非常高,仅此一步就可以获得103∽104倍的纯化效果。但必须以抗体和目的蛋白的特异性结合为前提。在纯化过程中,由于单抗与相应抗原之间具有了特异性结合部位,因而洗脱时只需破坏单一类型的相互作用就能释放目的蛋白。这样就能更大程度的保护目的蛋白,并且用于纯化的单抗可反复利用。

图4   抗Flag标签单克隆抗体在蛋白纯化的应用

(2)用于探索蛋白质的结构和功能:人们在所研究的目的蛋白分子的不同部位插入标签,就可以利用抗标签抗体对其分子结构进行研究。抗标签抗体还可以用来研究蛋白质分子的功能特别是是用来研究膜受体的功能。不同配体与膜受体结合后,一般首先通过交联作用引起受体的聚集,即受体发生二聚或多聚化,然后多聚化的受体再向胞内传递信号。这种聚集作用往往是受体启动信号转导的必要条件,对某些受体还可能是充分条件。因此,在实验中可以利用抗标签蛋白抗体的交联活化受体,代替天然配体来研究受体的信号转导或功能。另外,将标签插入信号转导分子的特定结构域还可以用来研究分子的信号转导途径。

(3)其他:抗标签抗体还可以作为锚定蛋白将带有标签的融合蛋白固定到载体上。与其它固相化方法相比,抗体固定更能够保持融合蛋白的生物学活性和稳定性,因此在酶学、药物筛选等方面有广阔的应用前景。

(4)用于寻找相互作用的蛋白质:研究表明,大部分亲和标签在应用时都不会影响目的蛋白的空间构象和生物学功能。因此,抗标签的抗体在荧光标记后可以用于寻找与融合蛋白相互作用的蛋白质(包括目的蛋白的配体或受体)。

免疫沉淀技术是利用标签抗体寻找相互作用蛋白的另一种重要方法。与带有标签的目的蛋白相互作用的蛋白质可利用抗相应标签的抗体沉淀,并通过进一步的分离、纯化与鉴定,即可的到与目的蛋白相互作用的蛋白质的信息。免疫沉淀可以直接利用细胞的裂解液进行,也可以通过筛选cDNA文库进行。针对于目前常用的免疫沉淀技术,我司BiolinkedinÒ开发了一系列相应产品,有整套的免疫沉淀系列磁珠,其中就包括Flag标签的磁珠和凝胶产品,如下表2所示。

表2 BiolinkedinÒ相关产品

BiolinkedinÒ今天就分享到这啦,有兴趣的小伙伴可以申请试用或者联系我们销售。

参考文献:

[1] 李忠信.Flag标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究[D].河南:河南工业大学.2010

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