Protein A磁珠Protein G磁珠Protein L磁珠Protein A/G磁珠Protein A琼脂糖凝胶Protein G琼脂糖凝胶Protein L琼脂糖凝胶Protein A/G琼脂糖凝胶Anti-HA磁珠Anti-Myc磁珠Anti-DYKDDDDK磁珠(原Flag磁珠)链霉亲和素磁珠Anti-DYKDDDDK琼脂糖凝胶(原Flag凝胶)Anti-GST磁珠Anti-His磁珠Anti-GFP磁珠伴刀豆蛋白A(ConA)磁珠Protein A琼脂糖磁珠Protein G琼脂糖磁珠Protein A/G琼脂糖磁珠免疫沉淀磁珠His蛋白纯化琼脂糖凝胶GST蛋白纯化琼脂糖凝胶His蛋白纯化琼脂糖磁珠GST蛋白纯化琼脂糖磁珠Protein A Plus 琼脂糖磁珠Protein G Plus 琼脂糖磁珠Protein A/G Plus 琼脂糖磁珠蛋白抗体纯化磁珠PCR产物提取磁珠Oligo-dT包被磁珠核酸提取纯化磁珠羟基磁珠氨基磁珠羧基磁珠醛基磁珠NHS磁珠基础磁珠Protein A免疫(共)沉淀试剂盒Protein G免疫(共)沉淀试剂盒经典Protein A/G免疫(共)沉淀试剂盒Anti-HA免疫(共)沉淀试剂盒Anti-Myc免疫(共)沉淀试剂盒Anti-DYKDDDDK免疫(共)沉淀试剂盒Anti-DYKDDDDK免疫(共)沉淀试剂盒(凝胶法)Anti-GST免疫(共)沉淀试剂盒Anti-His免疫(共)沉淀试剂盒Anti-GFP免疫(共)沉淀试剂盒基础免疫(共)沉淀试剂盒His Pull-down试剂盒GST Pull-down试剂盒分子互作试剂盒His标签蛋白纯化试剂盒GST标签蛋白纯化试剂盒蛋白纯化试剂盒mRNA纯化试剂盒基础mRNA纯化试剂盒核酸提取纯化试剂盒生物配体快速偶联试剂盒生物偶联试剂盒血浆/血清外泌体提取试剂盒(磁珠法)细胞上清外泌体提取试剂盒(磁珠法)尿液外泌体提取试剂盒(磁珠法)外泌体研究产品双排4孔 1.5mL磁力架双排8孔 1.5mL磁力架双排16孔 1.5mL磁力架双排4孔 15mL磁力架双排4孔 50mL磁力架八联排 0.2mL磁力架(PCR)双排八孔1.5mL磁力架(铝合金款)双排十六孔1.5mL磁力架(铝合金款)96孔PCR板磁力架(铝合金款)96孔酶标板磁力架(铝合金款)手持均质仪配套设备生物偶联技术高通量蛋白纯化外泌体定向改造IVD试剂研发服务磁珠应用外泌体专题纳米抗体神经科学领域新冠相关PROTAC技术翎因动态行业新闻优惠促销产品支持技术支持客户发表文章学习资源企业简介企业文化团队风采生产与质量联系我们
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蛋白纯化篇—GST标签蛋白亲和纯化

作者:JMY

一、谷胱甘肽S-转移酶(GST)概述

1.1 谷胱甘肽S-转移酶(GST)结构[1]

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是由多基因编码、具有多种功能的超家族酶,GST广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内的一种解毒系统中,其专一性催化还原型的谷胱甘肽巯基与其他化合物的亲电基团,生成谷胱甘肽衍生物,具有降低化学反应活性的效应。在各种生物体内,GSTs是由多个基因编码的、具有多种功能的一组同工酶,分子量为23∽29kDa,由200∽240个氨基酸组成。有膜结合和胞液两种形式,以胞液GSTs为主。根据蛋白酶的一级序列、免疫原性、酶动力学和三、四级结构的性质,GST又可以分为多个亚类。

图1   谷胱甘肽S-转移酶(GST)的三维结构

迄今为止,在人GST家族中共发现5类胞浆型同工酶,并分别进行了基因定位。其中,同工酶απμθ在人体内含量较丰富。人群中并非每个个体都含有这5种同工酶。不同的GST表型是由其编码基因的多态性决定的。该同工酶编码基因的纯合子缺失导致个体对某种同工酶的缺乏。目前,国内外研究主要集中于GSTμ、GSTθ、GSTπ这3类同工酶及其编码基因的多态性以及肿瘤易感性关系等领域。

GST同工酶的结构差异较大,氨基酸序列大约只有30%的相似性。其中,GSTαμπ的晶体结构具有相似的拓扑方式,每个酶分子都是由相同的两个亚单位二聚体折叠成两个结构域。大体上,其N端结构域与还原型谷胱甘肽(GSH)的活性位点结合,是由多肽链的氨基端区域的保守氨基酸残基基团组成,由80个氨基酸排列形成β-折叠和三股α螺旋构成,而且存在一个相当保守的酪氨酸残基(Try),该Try-5的-OH与GSH硫醇化阴离子形成氢键来稳定,从而在催化反应中起到重要作用。N-端结构域是GSH特异性结合位点(G位点)。C-末端氨基酸结构域由其余氨基酸以5∽6股α螺旋构成。C-末端氨基酸结构域是结合疏水底物的位点(H位点),该位点的结构可变性较大,可与各种不同的外源性物质结合。与上述3类同工酶不同的是GSTθ,它的Try-5的-OH不参与形成与GSTαπμ活性中心相似的氢键,而其Ser-9却参与了活性中心的形成。而其该Ser残基在所有GSTθ类同工酶中是相当保守的。

研究表明,尽管不同类型的GST氨基酸序列差异很大,但GST的二级结构及高级结构是非常相似的。每个可溶性GST是由约26kDa亚基组成的二聚体,形成疏水的50kDa的蛋白,等电点在pH45的范围内。G位点与H位点是由5-10个氨基酸残基组成的可变连接区连接。不同种类的GSTs氨基酸残端G位点的功能是不同的,各种GSTs形成的H位点也是不同。H位点的结构影响GST底物的特性,由于H位点的这种特殊性使GST超家族具有催化许多不同结构化合物反应的能力。不同种属的同型GSTs的同一结构域也有差异。

1.2 谷胱甘肽S-转移酶(GST)的应用[2]

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是具有多基因、多功能的II相代谢酶家族成员,广泛存在于动物、植物、昆虫、真菌、酵母和各种细菌中。能够催化还原型谷胱甘肽与各种亲电化合物进行亲核加成反应,从而使其极性提高,易于从尿液中排出。因此,GST家族蛋白是一类在外源化合物生物转化、保护机体免受过氧化作用损害和药物代谢过程中的一类极为重要的多功能蛋白质。

在生物研究领域,来源于日本血吸虫的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签,是目前应用最为广泛的融合标签之一。融合标签技术是利用DNA重组技术将某种标签编码基因融合于目的基因的3′端或5′端,再通过适宜的宿主来表达融合蛋白。表达的融合蛋白可以通过其融合标签与包被在固相基质上的特异性配基结合,从而纯化出融合蛋白。1988年,Smith和Johnson首次提出GST融合蛋白的亲和纯化法,此后广泛使用。目前,国内外纯化GST融合蛋白的主要方法是亲和纯化法。GST标签蛋白亲和纯化,其配基通常是GST的底物谷胱甘肽(GSH),通过酶与底物的特异性结合来实现GST蛋白的分离纯化。其原理是:在固相基质上通过巯基结合一个谷胱甘肽,然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶之间的特异性作用力,使得带GST标签的融合蛋白与基质上的谷胱甘肽结合,达到分离纯化的目的。

图2   固相基质与配基GSH偶联实现GST标签蛋白亲和纯化

自GST融合蛋白亲和纯化法问世以来,GST-pull down技术也随即成为一种研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的热门手段。该技术的原理是:利用重组技术将诱饵蛋白与GST标签融合表达,融合表达的蛋白经纯化后与待测蛋白共同孵育,并用GST琼脂糖凝胶或GST琼脂糖磁珠将其分离下来,再通过SDS-PAGE鉴定待测蛋白与诱饵蛋白的相互作用。这种方法简单易行,操作简单。此外,GST标签还有助于对目标蛋白的检测。

图3   GST-pull down技术

二、GST标签蛋白的纯化[3]

谷胱甘肽亲和是一种高效的方法,可以一步纯化GST标签蛋白。无论是大肠杆菌或者其他宿主细胞中,天然表达的还是重组表达的,各种来源的GST标签蛋白,都可以用固定的谷胱甘肽亲和层析方法纯化,然后用过量的还原性谷胱甘肽竞争洗脱。

GST可以在大肠杆菌细胞质中以可溶性蛋白的形式大量表达,并具有充分的酶活性。此外,许多在大肠杆菌中表达不溶性的真核蛋白被证明在表达为GST融合蛋白时至少部分溶性。当与另一蛋白质的N端融合时,酶的活性通常保持不变。为了生成表达GST融合蛋白的结构,目的蛋白的编码序列可以使用标准克隆技术插入到商业上可用的载体,如pGEX(GE Healthcare)或pET(Novagen)系列质粒。

固定上谷胱甘肽的GST亲和树脂可用于各种商业来源的GST融合蛋白的纯化,通过它们与亲和配体谷胱甘肽的强特异性结合。整个流程如图4所示。

图4   GST标签蛋白亲和纯化示意图

2.1 GST标签作用机理

(1)应用于原核表达,作为一种高度可溶的蛋白,能增加外源蛋白的可溶性,在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用;

(2)GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性;

(3)GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂(如:盐酸胍或尿素等);

(4)GST融合蛋白已经成为分子生物学领域的基本工具,其广泛用于研究蛋白质-DNA及蛋白质-蛋白质间的相互作用,也可作为抗原用于免疫学或疫苗的研究。

(5)GST标签的切除:①凝血酶:一种应用很广泛的蛋白酶,主要特点是经凝血酶切割后的重组蛋白在切割位点的C端会保留两个氨基酸残基。凝血酶可以识别两种类型的氨基酸序列,分别为X4-X3-P-P[K]-X1΄-X2΄和X2-R[K]-X1΄,凝血酶对前一种序列的识别效果更为理想。②Xa因子:Xa因子是一种较高效的去除融合标签的工具酶,可特异性识别I-E[D]-G-R-X1序列,并将融合标签从其C末端切除。

2.2 GST标签纯化蛋白的优劣势

GST标签纯化蛋白的优劣势如表1所示。

表1   GST标签纯化蛋白的优劣势

优势

劣势

1.   适用范围广,可在不同宿主中表达;

2.   增强外源蛋白可溶性;

3.   可用不同的蛋白酶进行去除;

4.   有助于保持蛋白的抗原性与生物活性,提高外源蛋白的稳定性;

5.   特异性好,纯化方便且温和。


1.   分子量较大,可能会影响蛋白质的功能和下游实验;

2.   仅能纯化可溶性蛋白,若蛋白不可溶,则很难用变性的方法纯化。

2.3 GST标签纯化蛋白的常见问题及解决

GST标签纯化蛋白的常见问题及解决方案如表2所示。

表2   GST标签纯化蛋白的常见问题及解决方案

问题

原因

解决方案

GST 融合蛋白的产量低或无法检测到

融合蛋白形成包涵体

采用低温(16∽25℃)培养细胞,或者诱导过程中降低诱导剂的终浓度至1mM,或者缩短诱导时间。

纯化前需要完全融解和复性。将裂解液与GST标签蛋白纯化琼脂糖凝在摇床上轻摇2个小时或者更长时间(过夜),充分结合后上柱纯化。

融合蛋白可能失活

采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件,比如采用溶菌酶。

融合蛋白被蛋白酶降解

在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑制剂,如PMSF。

融合蛋白不能有效地从树脂上洗脱下来

延长洗脱时间,或者增加洗脱液中还原性谷胱甘肽的浓度至15mM或者更高

调节洗脱液的pH值至8.0∽9.0。

在洗脱液中加入Triton X-100(终浓度0.1%)、辛基-葡萄糖苷(终浓度2%)或者NaCl(终浓度0.1∽0.2 M)。

洗脱液中有较多杂带

融合蛋白被蛋白酶降解

在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑制剂如PMSF。

一些宿主蛋白,比如伴侣蛋白,可能会和融合蛋白互相

作用

在洗涤液中加入DTT(终浓5 mM)。在纯化前将重组蛋白溶液和伴侣蛋白溶液(2 mM ATP, 10mM MgSO4, 50 mM   Tris-HCl),37℃振荡10 min

过度的超声处理会导致一些蛋白与融合蛋白相结合

采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件。

有些蛋白会与融合蛋白或树脂发生非特异性结合

优化洗涤条件:加入一些洗涤剂如1%   Triton X-100、1%Tween-20、0.03%   SDS 或者0.1% NP-40 可以降低非特异性吸附。优化洗涤液中的盐浓度也可以降低非特异性吸附。

三、BiolinkedinÒ相关产品

针对于目前常用的GST标签蛋白纯化,我司开发了一系列相应产品,如下表3所示。

表3   BiolinkedinÒ相关产品

货号

产品名称

L-2002

GST标签蛋白琼脂糖凝胶

L-2004

GST标签蛋白琼脂糖磁珠

BiolinkedinÒ今天就分享到这啦,有兴趣的小伙伴可以申请试用或者联系我们销售。

参考文献:

[1]王政. 抗GST标签蛋白单克隆抗体的制备及其活性鉴定[D]. 湖北:华中农业大学,2008.

[2]沈方圆. 标签蛋白GST纳米抗体的制备以及rs11614913、rs2910164多态性与ESCC易感性的关联研究[D]. 江苏:苏州大学,2016.

[3]Schfer F ,   Seip N ,   Maertens B , et al. Purification ofGST-Tagged Proteins[J]. Methods in enzymology, 2015, 559:127-139.



Chapter Nine - Purification of GST-Tagged Proteins.pdf


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