蛋白纯化篇—GST标签蛋白亲和纯化

一、谷胱甘肽S-转移酶（GST）概述

1.1 谷胱甘肽S-转移酶（GST）结构^[1]

谷胱甘肽S-转移酶（GST）是由多基因编码、具有多种功能的超家族酶，GST广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内的一种解毒系统中，其专一性催化还原型的谷胱甘肽巯基与其他化合物的亲电基团，生成谷胱甘肽衍生物，具有降低化学反应活性的效应。在各种生物体内，GSTs是由多个基因编码的、具有多种功能的一组同工酶，分子量为23∽29kDa，由200∽240个氨基酸组成。有膜结合和胞液两种形式，以胞液GSTs为主。根据蛋白酶的一级序列、免疫原性、酶动力学和三、四级结构的性质，GST又可以分为多个亚类。

图1   谷胱甘肽S-转移酶（GST）的三维结构

迄今为止，在人GST家族中共发现5类胞浆型同工酶，并分别进行了基因定位。其中，同工酶α、π、μ及θ在人体内含量较丰富。人群中并非每个个体都含有这5种同工酶。不同的GST表型是由其编码基因的多态性决定的。该同工酶编码基因的纯合子缺失导致个体对某种同工酶的缺乏。目前，国内外研究主要集中于GSTμ、GSTθ、GSTπ这3类同工酶及其编码基因的多态性以及肿瘤易感性关系等领域。

GST同工酶的结构差异较大，氨基酸序列大约只有30%的相似性。其中，GSTα、μ、π的晶体结构具有相似的拓扑方式，每个酶分子都是由相同的两个亚单位二聚体折叠成两个结构域。大体上，其N端结构域与还原型谷胱甘肽（GSH）的活性位点结合，是由多肽链的氨基端区域的保守氨基酸残基基团组成，由80个氨基酸排列形成β-折叠和三股α螺旋构成，而且存在一个相当保守的酪氨酸残基（Try），该Try-5的-OH与GSH硫醇化阴离子形成氢键来稳定，从而在催化反应中起到重要作用。N-端结构域是GSH特异性结合位点（G位点）。C-末端氨基酸结构域由其余氨基酸以5∽6股α螺旋构成。C-末端氨基酸结构域是结合疏水底物的位点（H位点），该位点的结构可变性较大，可与各种不同的外源性物质结合。与上述3类同工酶不同的是GSTθ，它的Try-5的-OH不参与形成与GSTα、π、μ活性中心相似的氢键，而其Ser-9却参与了活性中心的形成。而其该Ser残基在所有GSTθ类同工酶中是相当保守的。

研究表明，尽管不同类型的GST氨基酸序列差异很大，但GST的二级结构及高级结构是非常相似的。每个可溶性GST是由约26kDa亚基组成的二聚体，形成疏水的50kDa的蛋白，等电点在pH4∽5的范围内。G位点与H位点是由5-10个氨基酸残基组成的可变连接区连接。不同种类的GSTs氨基酸残端G位点的功能是不同的，各种GSTs形成的H位点也是不同。H位点的结构影响GST底物的特性，由于H位点的这种特殊性使GST超家族具有催化许多不同结构化合物反应的能力。不同种属的同型GSTs的同一结构域也有差异。

1.2 谷胱甘肽S-转移酶（GST）的应用^[2]

谷胱甘肽S-转移酶（GST）是具有多基因、多功能的II相代谢酶家族成员，广泛存在于动物、植物、昆虫、真菌、酵母和各种细菌中。能够催化还原型谷胱甘肽与各种亲电化合物进行亲核加成反应，从而使其极性提高，易于从尿液中排出。因此，GST家族蛋白是一类在外源化合物生物转化、保护机体免受过氧化作用损害和药物代谢过程中的一类极为重要的多功能蛋白质。

在生物研究领域，来源于日本血吸虫的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标签，是目前应用最为广泛的融合标签之一。融合标签技术是利用DNA重组技术将某种标签编码基因融合于目的基因的3′端或5′端，再通过适宜的宿主来表达融合蛋白。表达的融合蛋白可以通过其融合标签与包被在固相基质上的特异性配基结合，从而纯化出融合蛋白。1988年，Smith和Johnson首次提出GST融合蛋白的亲和纯化法，此后广泛使用。目前，国内外纯化GST融合蛋白的主要方法是亲和纯化法。GST标签蛋白亲和纯化，其配基通常是GST的底物谷胱甘肽（GSH），通过酶与底物的特异性结合来实现GST蛋白的分离纯化。其原理是：在固相基质上通过巯基结合一个谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶之间的特异性作用力，使得带GST标签的融合蛋白与基质上的谷胱甘肽结合，达到分离纯化的目的。

图2   固相基质与配基GSH偶联实现GST标签蛋白亲和纯化

自GST融合蛋白亲和纯化法问世以来，GST-pull down技术也随即成为一种研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的热门手段。该技术的原理是：利用重组技术将诱饵蛋白与GST标签融合表达，融合表达的蛋白经纯化后与待测蛋白共同孵育，并用GST琼脂糖凝胶或GST琼脂糖磁珠将其分离下来，再通过SDS-PAGE鉴定待测蛋白与诱饵蛋白的相互作用。这种方法简单易行，操作简单。此外，GST标签还有助于对目标蛋白的检测。

图3   GST-pull down技术

二、GST标签蛋白的纯化^[3]

谷胱甘肽亲和是一种高效的方法，可以一步纯化GST标签蛋白。无论是大肠杆菌或者其他宿主细胞中，天然表达的还是重组表达的，各种来源的GST标签蛋白，都可以用固定的谷胱甘肽亲和层析方法纯化，然后用过量的还原性谷胱甘肽竞争洗脱。

GST可以在大肠杆菌细胞质中以可溶性蛋白的形式大量表达，并具有充分的酶活性。此外，许多在大肠杆菌中表达不溶性的真核蛋白被证明在表达为GST融合蛋白时至少部分溶性。当与另一蛋白质的N端融合时，酶的活性通常保持不变。为了生成表达GST融合蛋白的结构，目的蛋白的编码序列可以使用标准克隆技术插入到商业上可用的载体，如pGEX（GE Healthcare）或pET（Novagen）系列质粒。

固定上谷胱甘肽的GST亲和树脂可用于各种商业来源的GST融合蛋白的纯化，通过它们与亲和配体谷胱甘肽的强特异性结合。整个流程如图4所示。

图4   GST标签蛋白亲和纯化示意图

2.1 GST标签作用机理

（1）应用于原核表达，作为一种高度可溶的蛋白，能增加外源蛋白的可溶性，在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用；

（2）GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性；

（3）GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂（如：盐酸胍或尿素等）；

（4）GST融合蛋白已经成为分子生物学领域的基本工具，其广泛用于研究蛋白质-DNA及蛋白质-蛋白质间的相互作用，也可作为抗原用于免疫学或疫苗的研究。

（5）GST标签的切除：①凝血酶：一种应用很广泛的蛋白酶，主要特点是经凝血酶切割后的重组蛋白在切割位点的C端会保留两个氨基酸残基。凝血酶可以识别两种类型的氨基酸序列，分别为X4-X3-P-P[K]-X1΄-X2΄和X2-R[K]-X1΄，凝血酶对前一种序列的识别效果更为理想。②Xa因子：Xa因子是一种较高效的去除融合标签的工具酶，可特异性识别I-E[D]-G-R-X1序列，并将融合标签从其C末端切除。

2.2 GST标签纯化蛋白的优劣势

GST标签纯化蛋白的优劣势如表1所示。

表1   GST标签纯化蛋白的优劣势

2.3 GST标签纯化蛋白的常见问题及解决

GST标签纯化蛋白的常见问题及解决方案如表2所示。

表2   GST标签纯化蛋白的常见问题及解决方案

三、BiolinkedinÒ相关产品

针对于目前常用的GST标签蛋白纯化，我司开发了一系列相应产品，如下表3所示。

表3   BiolinkedinÒ相关产品

BiolinkedinÒ今天就分享到这啦，有兴趣的小伙伴可以申请试用或者联系我们销售。

参考文献：

[1]王政. 抗GST标签蛋白单克隆抗体的制备及其活性鉴定[D]. 湖北:华中农业大学,2008.

[2]沈方圆. 标签蛋白GST纳米抗体的制备以及rs11614913、rs2910164多态性与ESCC易感性的关联研究[D]. 江苏:苏州大学,2016.

[3]Schfer F ,   Seip N ,   Maertens B , et al. Purification ofGST-Tagged Proteins[J]. Methods in enzymology, 2015, 559:127-139.