浅谈|蛋白制备纯化之缓冲液置换（小技巧篇）

缓冲体系在蛋白制备纯化过程中非常重要，合适缓冲液能确保蛋白活性和结构稳定。为了满足蛋白后续纯化，往往需要对缓冲液进行置换。下面介绍几种常见的纯化场景，

场景一：针对分泌表达蛋白或抗体，其存在于培养基或腹水中，相对成分复杂，后续纯化需要置换缓冲体系，避免影响亲和纯化的效率。

场景二：有些蛋白经过亲和纯化后需要进行进一步纯化（如离子交换层析），在进行离子交换之前需要将盐离子降低或pH调整，此时需要置换缓冲液。

场景三：蛋白经过离子交换层析后，还需要进行下一步离子交换层析需要调整pH，此时需要置换缓冲液。

场景四：对于包涵体复性纯化，因含有变性剂（盐酸胍或尿素等）需要去除避免影响下游纯化，此时需要置换缓冲液。

针对上述情况，可采取如下常用方式：

常规方法主要有透析，超滤和凝胶过滤层析。

A    .透析法

这种方法主要利用透析袋小分子能通过而蛋白质大分子不能透过半透膜的原理。一般12 - 24h透析2 - 4次可完成对缓冲液的置换。该方法实验室比较常用，样品回收率高，操作简单，成本低廉。

透析袋的选择：

1.1 首先确定透析袋的分子量

在选择适合截留分子量之前，首先要明确：欲保留在透析袋中的样品和想要除去的杂质的分子量。

1.2 选择普通型，再生型或者纤维素透析袋

确定好分子量之后，根据实际情况，样品溶剂等，选择透析袋。

1.3正确选择扁平宽度

透析袋扁平宽度的选择取决于样品体积和透析容量。较小的透析管透析更快；较大的透析管因扩散距离较长透析较慢。为易于使用，建议使用总长（包括闭合夹和顶部空间）为大约10 - 15cm的透析袋。

B.超滤

超滤属于膜分离技术，主要借助超滤膜完成分离介质的作用，以超滤膜两侧的压力差为动力，结合料液中各组分在高分子膜中传输的不同点，对原有的物质进行分析，分级和纯化，从而达到脱盐浓缩的作用。

超滤法可以选择超滤管，超滤杯，以及工业级的超滤系统。

实验室超滤管的选择：

超滤离心管的选择主要根据要截留那部分物质，选择比最小分子量小的，如果要截留35 KD的蛋白，就可以选择10 kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10 kD左右，则可以用截留分子量3 kD的超滤管。

C凝胶过滤层析

主要利用不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留时间不同，凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离。比如Sephadex G-25 凝胶过滤介质应用于生物大分子的脱盐和缓冲液置换，特别是在离子交换及亲和层析后脱盐及缓冲液置换中比较常用。

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