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LAB  ON THE MAGNETICBEADS
产品详情
oligo-dT磁珠
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oligo-dT磁珠
货号: L-3002/L-3002A
规格: 2mL/5mL
价格: ¥ 2499/4999
产品详情

产品描述

本产品用于从总RNA或直接从动物组织、植物或细胞中快速分离出高纯度且完整的mRNA。可以广泛的应用到各种样品中。磁珠上的oligo-dT与mRNA的polyA杂交。操作简单易行,仅需几步洗脱和磁分离,所有操作都在单管中一次完成。磁操作最大的优点就是容易清洗、分离以及浓缩磁珠结合的材料。

产品信息

项目

特性

粒径

200 nm

结合能力

~10 ug mRNA/mg磁珠

浓度

10 mg/mL

保存液

0.1 M Tris-HCl,pH 7.5, 20 mM EDTA,含0.1%(v/v)Tween -20,0.1%(w/v)NaN3

保质期

在2-8°C稳定保存,保质期两年

对应样品

对应样品

样品量

培养细胞

∽1×107

动物组织

∽50 mg

植物组织

∽100 mg

总RNA

∽100 ug

推荐buffer组份

项目

组份

结合缓冲液

20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM   EDTA.

裂解/结合缓冲液

100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM   EDTA, 1% LiDS, 5 mM dithiothreitol (DTT).

洗涤液Ⅰ

10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM   EDTA, 0.1% LiDS.

洗涤液Ⅱ

10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM   EDTA 10 mM Tris-HCl,pH 7.5.

注意事项

1. 实验操作

在进行RNA实验时,必须注意要抑制RNase的作用。因此,除了要防止通过使用器具以及试剂中混入RNase,即注意实验环境之外,还要防止通过唾液,汗等混入RNase,故建议戴上口罩和手套。

2. 器材

在实验器材允许的情况下,请对一次性塑料制品进行高温高压湿热灭菌处理。在使用玻璃器皿的情况下,请使用干热灭菌,或者在0.1% DEPC溶液中,37℃下浸泡12小时,然后再进行高温高压湿热灭菌(121℃,30分钟)。

操作流程

1. 磁珠预处理

(1)将磁珠悬液漩涡振荡30 s,使磁珠充分震荡重悬;

(2)取出100 μL磁珠悬液至合适的反应管(1.5 mL EP管或PCR管)中;将反应管置于磁性分离器上,待溶液变澄清后【后续该操作简称为“磁性分离”】,移去上清液,从磁性分离器上取下反应管;

(3)加入1mL结合缓冲液重悬磁珠,用移液器缓慢吹打5~10次或漩涡震荡30 s。

(4) 磁性分离,去上清,加入100 μL结合缓冲液重悬磁珠。

2. 样品前处理

(1)动物/植物组织

a.将所需量的植物或动物组织快速并完全均质化在液氮中。

b.将冷冻粉收集并转移到新鲜的管中。每100毫克组织添加1mL结合缓冲液,充分混匀,并在室温下旋转混合5分钟。

c.通过用针头通过数次的吸入和吸出剪切DNA来降低溶液粘度。

d.在室温下以14,000rpm离心5min,并将所有上清液转移至一个新鲜的EP管。上清液可以进行mRNA纯化,或保存在-80℃以备将来使用。

(2)细胞悬浮液

a.室温下以4,000rpm离心5min沉淀细胞并丢弃上清液。每5-10x106个动物或植物细胞加1ml结合缓冲液。

b.通过移液多次溶解细胞直至溶液变粘稠。通过用针头通过数次的吸入和吸出剪切DNA来降低溶液粘度。

c.在室温下以14,000rpm离心5min,并将所有上清液转移至一个新鲜的EP管。上清液可以进行mRNA纯化,或保存在-80℃以备将来使用。

3. 提取mRNA

a.制备动物/植物组织裂解液或从培养细胞和细胞悬浮液中制备裂解液。

b.按照“一、磁珠预处理步骤”对磁珠进行处理。

c.将裂解液与磁珠混合,室温下旋转混合3-5分钟。

d. 磁性分离,静置2min, 去上清。

e. 室温下分别用1ml洗涤液Ⅰ和1ml洗涤液Ⅱ清洗磁珠,去除可能的污染物。

f. 如果分离mRNA用于酶促下游应用(例如固相cDNA合成),洗涤液Ⅱ(500μL)洗涤一次,随后用酶缓冲液洗涤一次,可用于下游应用。

如果从磁珠中洗脱mRNA,洗涤液Ⅱ洗涤后并加入10~20μl 10mMTris-HCl,75°C-80°C孵育2分钟,然后快速将含有mRNA的上清液转移到新的RNase-free EP管。

4. Total RNA中纯化mRNA

以纯化75ug Total RNA为例

a.     取100ul含有75ug Total RNA 与100ul结合缓冲液混合,

b.    65°C孵育2min,打开RNA二级结构,结束后迅速置于冰上。

c.     将上述混合液室温下旋转混合3-5分钟。

d.    磁性分离,静置2min,去上清。

e.     室温下分别用1ml洗涤液Ⅰ和1ml洗涤液Ⅱ清洗磁珠,去除可能的污染物。

f.      加入10~20μl 10mM Tris-HCl,75°C-80°C孵育2分钟,然后快速将含有mRNA的上清液转移到新的RNase-free EP管。

常见问题及对策

发生问题时,请参照以下的对策。

1. RNA的回收量低

原因

对策

样品保存状态欠佳

在采取完样品材料后请立即冻结·保存。

溶解处理不充分

样品在溶解液内溶解时,请充分匀浆,并使其通过装有注射针的针筒以降低粘性。另外,对于组织,请事先进行充分的冻结破碎工作。

样品过于坚硬

请充分进行冻结破碎,或进行匀浆。

样品量过剩

样品量过剩时,会使粒子凝集,粘性变高,回收量下降。请降低样品量。

样品中所含RNA量过少

请通过AGPC法等其他方法对大量的样品进行处理,以制备Total RNA,并使用本试剂盒制备mRNA。

2. RNA被分解

原因

对策

样品保存状态欠佳

在采取完样品材料后请立即冻结·保存。

冻结样品在使用前已经融解

样品尽可能保存在液氮中,使用时请迅速放入溶解液中溶解。

混入Rnase

请戴上手套和口罩。另外,请避免和使用RNase的其他实验使用同一个器具及场所等。

对RNA加温处理

如果RNA在反应缓冲剂中长时间加温则会分解。若需要长时间加温,请使用添加了RNase Inhibitor的反应缓冲剂。另外,加温时请尽量控制温度在72℃以下。

3. RNA的纯度低

原因

对策

样品量过剩

请考虑减少样品量。

试剂还没有完全回复到室温状态

对于酶以外的试剂请先待其回复到室温后再加以使用。

洗净时的磁珠混合不充分

仅通过倒转混合有时并不能充分混匀。在没有使用漩涡混合器的情况下,请通过pipetting进行混合。

4. RT-PCR结果不良

原因

对策

混入基因组DNA

已证实在没有进行DNase I 处理的情况下特别容易混入基因组DNA。请先进行DNase I 处理。另外,在进行RT-PCR时,推荐对未进行逆转录反应的样品也进行PCR操作,以便确认来自基因组DNA的增幅产物是否存在。

RNA的分解

参照相关操作程序 [9] 2.

洗净不充分

溶解液中含有蛋白变性剂。请对溶解液充分洗净,并仔细去除上清液。如果觉得溶出后的样品内混入了蛋白变性剂(若A260/A280的数值变高),请在酶反应前进行乙醇沉淀。

5. 磁珠凝结,无法分开

原因

对策

溶解处理不充分

样品溶解时,请透过装有注射针的针筒。根据样品的破碎状态,此项操作可能会比较困难。这种情况下请通过pipetting来降低液体的粘性。

样品量过剩

如果处理时样品量过剩,就可能引起粒子凝集,回收量低下。请考虑减少样品量。   

注意:本产品仅供科学研究使用,不能用于人、动物的医疗或诊断程序,不能使用本产品作为食品、化妆品或家庭用品等。


资料下载

olido-dT包被磁珠说明书




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