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产品详情
His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶
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His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶
货号: L-2001/L-2001A
规格: 10mL/100mL
价格: ¥ 499/3999
产品详情

产品描述

His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶是由高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,用于纯化各种表达系统融合表达的His重组蛋白。

产品特点

基质

高度交联的4%琼脂糖微球

载量

>40   mg 6xHis蛋白

粒径

45-165μm

储存&稳定性

2‐8℃储存24个月

储存缓冲液

20% 乙醇

体积

10mL   (5mL凝胶)

纯化步骤

1.   准备buffer

平衡缓冲液50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,用NaOH 调pH为8.0

洗涤液: 50mM NaH2PO4,300 mM NaCl,10 mM咪唑,用NaOH 调pH 为8.0

洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,250 mM 咪唑,用NaOH 调pH 为8.0

所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤。减少杂质,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.   样品准备

以大肠杆菌表达系统为例

1). 4℃离心30 分钟(4000 g)收集菌体,弃上清。

2). 用冷平衡缓冲液重悬细胞, 如果需要,可加入适量的添加剂,如蛋白酶抑制剂(PMSF)或其他蛋白酶抑制剂等。

注意:加入的抑制剂不能对Ni-IDA 亲和层析介质的性能有影响,破碎液中不能含有EDTA、EGTA 等螯合剂,DTT、巯基乙醇等还原剂,尿素、盐酸胍等变性剂。

3). 用超声波破碎法在冰上破碎菌体,直到样品破碎完全。

可选:如果裂解物太粘稠,可以加入RNase A (终浓度10 μg/ml) 和DNase I (终浓度5 μg/ml) 并在冰上孵育10-15分钟。

4) 4℃离心20分钟(12,000 g),除菌过滤,并小心将上清和沉淀分离。

5).SDS-PAGE 分析His融合蛋白的含量及可溶性。

3.纯化重组His融合蛋白

1). 轻轻重悬His琼脂糖凝胶。

2). 吸取适量的His琼脂糖凝胶至重力柱中,用5-10 倍柱体积的冷平衡缓冲液平衡His琼脂糖凝胶。

3). 将制备好的含有His 融合蛋白澄清菌液加入到层析柱中,流速控制为0.5-1 ml/min,

4). 裂解菌液全部流出层析柱后就立刻加入洗涤液清洗层析柱,所需量大约为柱体积的10-20 倍或者直到流出液的A280 值达到最低且稳定;

5). 用5-10 倍柱体积的洗脱缓冲液以0.5-1ml/分钟的流速洗脱,收集洗脱液。或者根据流出液A280 值判断,当数值陡然上升时开始接收洗脱液,直到A280 数值降至最低且稳定停止收集。根据目的蛋白的性质和用途选择透析到20 mMTris-HCl,pH 8.0 或者1 ×PBS,pH 7.4 中。

4.树脂再生及储存

His标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生,但随着使用次多较多,非特异性结合的蛋白增多和蛋白的聚集,往往造成流速和结合载量都下降,这时需要对树脂进行清洗。

按照下面操作流程进行镍离子剥离和重新挂镍离子。

1) 使用 5 倍柱体积去离子水清洗填料;

2) 使用 5 倍柱体积 100 mMEDTA (pH 8.0)剥落镍离子;

3) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗填料;

4) 使用5 倍柱体积0.5M NaOH 清洗,

5) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗填料;

6) 使用 3-5 倍柱体积 100 mMNiSO4 再生挂镍;

7) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗;

填料再生后,可以立即使用,如不立即使用,需要将填料悬浮于等体积的 20%乙醇中,置于 2-8°C 保存。


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His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶


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