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LAB  ON THE MAGNETICBEADS
产品详情
His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠
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His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠
货号: L-2003/L2003A
规格: 5mL/100mL
价格: ¥ 999/9999
产品详情




产品描述

Ni-IDA Magnetic Agarose Beads是由高度交联的4%磁性琼脂糖凝胶为基质,用于纯化各种表达系统融合表达的His重组蛋白。

产品特点

基质

高度交联的4%磁性琼脂糖微球

载量

>10   mg 6xHis蛋白

粒径

30-100μm

   储存&稳定性

2‐8℃储存24个月

储存缓冲液

20% 乙醇

体积

5ml(琼脂糖磁珠占20%)

纯化步骤

1.     准备buffer

结合/平衡缓冲液50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,10 mM咪唑,用NaOH 调pH 为8.0

洗涤液: 50mM NaH2PO4,300 mM NaCl,20 mM咪唑,用NaOH 调pH 为8.0

洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,250 mM 咪唑,用NaOH 调pH 为8.0

所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤。减少杂质,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

注:上述缓冲液适用多数His标签蛋白纯化,结合/平衡缓冲液中加入一定咪唑有助于降低非特异性结合,用户也可根据实验结果调整缓冲液中的咪唑浓度。

2.     样品准备

以大肠杆菌表达系统为例

1). 4℃离心30 分钟(4000 g)收集菌体,弃上清。

2). 用冷结合/平衡缓冲液重悬细胞, 如果需要,可加入适量的抑制剂,如蛋白酶抑制剂(PMSF)或其他蛋白酶抑制剂等。

注意:加入的抑制剂不能对Ni-IDA Magnetic Agarose Beads的性能有影响,破碎液中不能含有EDTA、EGTA 等螯合剂,DTT、巯基乙醇等还原剂,尿素、盐酸胍等变性剂。

3). 用超声波破碎法在冰上破碎菌体,直到样品破碎完全。

可选:如果裂解物太粘稠,可以加入RNase A (终浓度10 μg/ml) 和DNase I (终浓度5 μg/ml) 并在冰上孵育10-15分钟。

4) 4℃离心20分钟(12,000 g),除菌过滤,并小心将上清和沉淀分离。

5).SDS-PAGE 分析His融合蛋白的含量及可溶性。

3.   纯化重组His融合蛋白

1). 将Ni-IDA Magnetic Agarose Beads充分混匀,使用移液器取适量的磁珠悬浮液,置于离心管中,磁性分离,弃上清。

2). 加入与上述磁珠悬浮液等体积的平衡缓冲液,使用移液器反复吹打5-10次,磁性分离,弃上清,重复洗涤2次。

3). 将制备好的含有His 融合蛋白澄清菌液加入到处理好的磁珠中,颠倒混匀。将离心管置于混匀仪上,室温孵育30min。(也可置于2-8孵育1h或者过夜)

4). 结合结束后,将离心管置于磁力架上,磁性分离,弃上清(保留,以备检测)。向离心管中加入2倍悬浮液体积的洗涤液,移液器反复吹打5-10次,然后磁性分离,用移液器吸取上清(保留,以备取样检测)。重复上述步骤3次。

5). 洗脱蛋白时可根据需要调整洗脱体积从而调整蛋白浓度的目的。建议用2-5 倍柱体积的洗脱缓冲液加入到离心管中,移液器轻轻吹打3-5次,混匀,磁性分离,然后用移液器吸取上清液,即为目的蛋白。如有需要,可以重复上述步骤1次,以提高蛋白回收量。

6). SDS-PAGE检测纯化效果

4.   磁珠处理

1).将装有磁珠的离心管中加入1ml 洗脱缓冲液,用移液器反复吹打3-5次,使磁珠重复悬浮,然后置于磁力架,磁性分离,弃上清,重复该操作2次。向离心管中加入1ml去离子水,用移液器反复吹打3-5次,使磁珠重复悬浮,然后置于磁力架,磁性分离,弃上清,重复该操作2次。最后加入20%乙醇中,使总体积等于初始悬浮液体积,置于 4-8°C 保存。


资料下载

His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠产品说明书

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