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Protein A/G Magnetic Beads
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Protein A/G Magnetic Beads
货号: L1004
规格: 1mL
价格:
999.00
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产品描述

      Protein A/G磁珠在大小为0.2 um的纳米磁珠上共价结合了大量的Protein A/G蛋白,与传统的Protein A/G免疫沉淀琼脂糖凝胶比较,抗体结合能力相同,背景更低的特点,由于采用磁性分离,使得每次IP和CoIP可以节省40%的时间。

名称

特性

磁珠大小

0.2 μm

磁珠浓度

10 mg/mL

IgG 结合量

0.5 mg/mL

适用范围

IP,CoIP等

稳定性

pH 6-8, 4oC长期稳定

储存条件

4oC

储存条件

pH 6-8, 4oC长期稳定,禁止产品冻结。

使用说明

1. 样品制备

请根据不同的样品选择合适的处理方法:

样品

样品处理

血清

若目标蛋白丰度较高,建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10~100   µg/mL,置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

悬浮细胞

离心收集细胞(4oC, 500 g, 10min),弃上清后称重,按每毫克细胞50µL的比例用1× PBS洗涤 2次;按每毫克细胞5~10 µL的比例加入结合缓冲液,同时加入蛋白酶抑制剂,混匀后置于冰上处理10min;离心收集上清液(4oC, 12000g,10min),置于冰上备用(或置于-20oC长期保存)。

贴壁细胞

移去培养基,按每 1.0×105个细胞150 µL的比例用1×PBS洗涤两次;用细胞刮棒刮脱细胞,收集至1.5 mLEP管内,按每 1.0×105个细胞20~30 µL的比例加入结合缓冲液,同时加入蛋白酶抑制剂,混匀后置于冰上处理10min,离心收集上清液(4oC, 12000g,10min), 置于冰上备用(或置于-20oC长期保存)。

大肠杆菌

离心收集大肠杆菌(4oC,12000g,2min),弃上清后称重,按每克(湿重)菌体10 mL的比例用1×PBS洗涤2次;按每克(湿重)菌体5~10 mL的比例加入结合缓冲液,同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF),重悬菌体,超声裂解细胞,离心收集上清(4oC,12000g,10min)。

2. 磁珠预处理:

将磁珠充分混匀,取25~50 µL磁珠,400 µL结合缓冲液洗涤3次,弃上清。

3. 抗体与磁珠结合:

3.1 抗体稀释:结合缓冲液稀释抗体至终浓度为5~50 µg/mL,置于冰上备用。

3.2 抗体结合:将准备好的400 µL抗体加入准备好的磁珠中,置于翻转混合仪孵育(常温30 min,4℃,2 h),后进行磁性分离,收集上清液置于冰上以备后续检测。

3.3洗涤(Washing):400 µL结合缓冲液洗涤3次,每次10min。

*注意:结合过程中,磁珠可能会出现聚团或呈片状,属于正常现象 ,不会影响实验结果。

4. 抗原与抗体-磁珠复合物结合

4.1 加入400 µL步骤1准备的样品,置于翻转混合仪(常温30 min,4℃,2 h)。

4.2 洗涤(Washing):400 µL结合缓冲液洗涤4次,每次5min。

4.3 洗脱(Elution):本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案,操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。

4.3.1 变性洗脱法:此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。分离磁珠,弃上清,向磁珠中加入60 µL 1× SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀,100℃加热10min。分离磁珠,收集上清,进行SDS-PAGE检测。

4.3.1非变性洗脱法:此方法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后期功能分析。分离磁珠,弃上清,向磁珠中加入25-50 µL洗脱缓冲液,室温孵育10 min;分离磁珠,收集上清液至新的EP管,并立即加入1 µL中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性,用于后期功能分析。

常见问题及对策

1:如何提高抗体与磁珠结合效率?

磁珠与抗体的结合效率与抗体的种属来源及所属亚型有关,请确认抗体的类型与 Protein A/G配基的亲和效率。如抗体所属亚型与Protein A/G的亲和度较低,可以通过增加抗体与磁珠的孵育时间(30~120min)、提高结合缓冲液的pH值(8~9)及降低离子强度(25~100mM NaCl)等方法提高亲和效率。

2:如何提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性?

可以先将抗体与样品进行孵育,形成抗体-抗原复合物,再用Protein A/G磁珠捕获复合物。这种方法可以提高抗体与抗原的结合效率,并降低磁珠与样品接触的时间,从而提高沉淀产物的特异性。对于蛋白质/核酸共沉淀或染色质免疫共沉淀也推荐使用此法。

3: 如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况?

磁珠应保存在2~8℃,使用时应避免由于污染而导致的不可逆聚集,或因干燥而导致的聚集。磁珠在低pH的洗脱缓冲液中发生聚集属于正常现象,不影响磁珠的正常使用。在Binding buffer和Elution buffer中添加终浓度为0.1%(v/v)的非离子型去垢剂(如NP-40、Tween-20或Triton X-100)可有效防止磁珠聚集。经过低pH洗脱操 作的磁珠可以用结合缓冲液洗涤至中性,然后用含有0.1%(v/v)Tween-20的Tris buffer(pH7.5)振荡重悬磁珠,并用超声波水浴处理2min,即可使磁珠恢复均匀状态,以上处理均不影响磁珠的抗体 结合效率。

4: 如何解决磁珠易粘附管壁的现象?

建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外,在缓冲液中添加 0.01%~0.1%(v/v)的非离子型去垢剂(如NP-40、Tween-20或TritonX-100)可以有效降低磁珠对耗材的粘附。

5: 磁珠在使用过程中出现结块现象?

磁珠在使用时如果出现结块现象一般较难振荡打散,容易导致分布不均,出现该问题的原因是磁珠在磁场中放置太久而使磁珠牢固的结合在一起。用超声波水浴处理 2min 即可打散磁珠使其重新分散, 但应注意超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落,所以磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法。

缓冲液汇总

IP & CoIP磁珠缓冲液汇总:

细胞裂解液:正常RIPA 细胞裂解缓冲液(一般是公司购买)

抗体磁珠结合buffer:PBST(1*PBS + 1% Triton X-100)

Washing buffer: PBST(1*PBS + 1% Triton X-100)

抗原与抗体/磁珠复合物binding buffer:可以用RIPA细胞裂解缓冲液代替

Washing buffer: PBST(1*PBS + 1% Triton X-100)

Elution buffer:

(1)变性洗脱缓冲液,直接加入1*蛋白loadingbuffer, 98℃ 5 min后弃去磁珠后,收集上清液检测。

(2)非变性洗脱缓冲液:Elutionbuffer: 0.1 M -0.2 M Glycine, 0.1%-0.5% Triton X-100 or Tween-20, pH 2.5-3.1。


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