Biolinkedin

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产品详情
Flag  IP/Co-IP Kit(凝胶)
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Flag  IP/Co-IP Kit(凝胶)
货号: IK-1013
规格: 40T/Kit
价格: ¥ 2299
产品详情

描述:

Biolinkedin®Flag-Tag免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒,包含足够完成 40 个反应的试剂,每个反应使用25 µL凝胶。能够高效完成抗原免疫沉淀(IP及免疫共沉淀(Co-IP)实验,抗体用量小于10μg且无需离心。

试剂盒中提供Biolinkedin®Anti-FlagAffinity Gel可以实现高效快速的抗原分离。免疫沉淀试剂盒配有经过优化预制的缓冲液,为免疫沉淀实验提供了最佳的反应条件,增强了免疫沉淀实验的稳定性。本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。

试剂盒组成:

Anti-Flag Affinity Gel

1 mL

IP Lysis/Wash Buffer

100 mL

SDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)

10 mL

Phosphatase   inhibitor cocktail(50×)

2 mL

PMSF(100×)

1 mL

Elution Buffer

5 mL

Neutralization Buffer

1 mL

产品优势

1.      具有高效的蛋白结合能力。

2.      超低非特异性吸附的性能。

3.      产品稳定性高。

操作流程

贴壁细胞样品:

1.      移去培养基,用PBS洗细胞两次。

2.      收集细胞至1.5 mLEP 管内,按比例加入IP Lysis/Wash Buffer,同时加入PMSF等相应的抑制剂,混匀后置于冰上静置5-20 min(期间混匀几次)。

3.      4 ℃, 12000-16000g,10 min离心收集上清液,置于冰上以备后续实验(或置于-80℃长期保存)。

培养皿IP Lysis/Wash Buffer推荐使用体积:

培养皿大小/表面积

IP Lysis/Wash Buffer体积

100 mm x 100 mm

500-1000 µL

100 mm x 60 mm

100-300 µL

6孔板

100-200 µL

悬浮细胞样品:

1.      4℃、500-1000 g、10 min,收集细胞,弃上清。

2.      用PBS 洗细胞一次,即用PBS 将细胞团重悬,4℃、500-1000g、10 min,收集细胞,弃上清。

3.      用预冷的IP Lysis/WashBuffer重悬细胞。每 1mg 细胞使用5-10μL IPLysis/Wash Buffer。同时加入PMSF等相应的抑制剂,混匀后置于冰上静置5-20 min(期间混匀几次)。

4.      4 ℃,12000 -16000 g,10 min离心收集上清液,置于冰上以备后续实验(或置于-80℃长期保存)。

血清样品:

一般建议建议用IP Lysis/Wash Buffer稀释血清样品至目标蛋白终浓度为50~150µg/mL,置于冰上备用(或置于-20 ℃长期保存)。

免疫沉淀:

注意:为保证凝胶均匀分布,使用前通过反复颠倒或轻微涡旋混匀瓶中凝胶。

1.      将25 µL的Biolinkedin® Anti-Flag Affinity Gel加入1.5 mL 离心管中。

2.      向凝胶中加入500 µL 预冷PBS,轻柔混匀。

3.      将离心管放入离心机中1000rpm,5min收集凝胶到离心管的底部,去除上清。

4.      向离心管中加入200-500 µL IP Lysis/WashBuffer。颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min。将离心管放入离心机中1000rpm,5min收集凝胶到离心管的底部,去除上清。

5.      将制备好含有Flag标记蛋白的样品加入装有凝胶的离心管中,保持混匀室温下孵育2-4 h。

6.      离心1000rpm,5min收集凝胶,除去未结合的样品,保存以备分析。

7.      向离心管中加入500 µL IPLysis/Wash Buffer,轻柔混匀。收集凝胶,弃上清。再重复洗两次。

8.      低 pH洗脱:向离心管中加入100 µL Elution Buffer。保持混匀在室温下孵育离心管5-10 min。离心1000rpm,5min分离凝胶,保留含有目的抗原的上清。每 100 µL 洗出液中加入10 µL NeutralizationBuffer来中和低pH。

9.      变性洗脱:向离心管中加入80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer(),将样品置于100℃水浴或者金属浴中加热10 min。离心1000rpm,5min分离凝胶,保留含有目的抗原的上清。

注意事项

1.      进行实验操作之前,请务必认真阅读本操作说明书。

2.      请勿高速离心、干燥或冷冻凝胶,这些操作会导致凝胶聚集而降低结合能力。

3.      IP实验中不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的,抗体与抗原结合还会受到IP Lysis/Wash Buffer的影响,因此,如使用本试剂盒不能获得最佳的实验结果,可自行优化操作细节或者筛选及配制缓冲液进行实验。

4.      微球使用前应充分振荡均匀。微球应保存在储存溶液中,防止干燥。

5.      本产品仅供研究使用。

6.      低温运输:Anti-Flag Affinity Gel、IP Lysis/Wash Buffer、Elution Buffer、Neutralization Buffer于4 ℃保存,PMSF、Phosphataseinhibitor cocktail、SDS-PAGE SampleLoading Buffer 于-20 ℃保存。

问题解决

1.      抗原没有免疫沉淀下来

a)      样品中所含的抗原过少,不足以被检测

建议:通过SDS-PAGE 或蛋白免疫印迹验证裂解液中蛋白的表达和/或裂解效率; 如果需要,加大样品量

b)     抗体无法结合抗原

建议:选择另一种特异性抗体,或者选择另一种识别不同抗原表位的抗体。

c)      IPLysis/Wash Buffer中的成分干扰了抗原与抗体的结合

建议:使用其它缓冲液进行免疫沉淀和漂洗(例如,含有 0.5% CHAPS的TBS)

2.      获得的蛋白量低

a)      蛋白质被降解

建议:加入蛋白酶抑制剂

b)     所使用的凝胶量不够

建议:提高捕获免疫复合物所使用的凝胶量

c)      样品中的目标蛋白量不够

建议:提高抗原样品量

3.      多条非特异条带

有非特异性的蛋白结合在凝胶上

建议:在IP Lysis/Wash Buffer中加入50-350 mM NaCl。加大洗脱力度和次数。

4.      凝胶易粘附管壁

建议:使用低吸附率的耗材进行凝胶操作。



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