描述:
Biolinkedin®基础免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒，包含足够完成 40 个反应的试剂，能够高效完成抗原免疫沉淀（IP）及免疫共沉淀（Co-IP）实验。
试剂盒中配有经过优化预制的缓冲液，为免疫沉淀实验提供了最佳的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳定性。本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。
试剂盒组成:
IP Lysis/Wash Buffer | 100 mL |
SDS-PAGE Sample Loading Buffer（5×） | 10 mL |
Phosphatase inhibitor cocktail（50×） | 2 mL |
PMSF（100×） | 1 mL |
Elution Buffer | 5 mL |
Neutralization Buffer | 1 mL |
产品优势
1. 适用Biolinkedin®免疫沉淀系列所有磁珠
2. 兼容其他同类型免疫沉淀系列磁珠
3. 兼容其他免疫沉淀系列琼脂糖凝胶、琼脂糖磁珠。
操作流程（以Biolinkedin®Protein A/G Magnetic Beads为例）
贴壁细胞样品：
1. 移去培养基，用 PBS 洗细胞两次。
2. 收集细胞至1.5 mL EP 管内，按比例加入IP Lysis/Wash Buffer，同时加入PMSF等相应的抑制剂，混匀后置于冰上静置5-20 min（期间混匀几次）。
3. 4 ℃,12000-16000 g,10 min离心收集上清液，置于冰上以备后续实验（或置于-80℃长期保存）。
培养皿IP Lysis/Wash Buffer推荐使用体积：
培养皿大小/表面积 | IP Lysis/Wash Buffer体积 |
100 mm x 100 mm | 500-1000 µL |
100 mm x 60 mm | 100-300 µL |
6孔板 | 100-200 µL |
悬浮细胞样品：
1. 4℃、500-1000 g、10 min，收集细胞，弃上清。
2. 用PBS 洗细胞一次，即用 PBS 将细胞团重悬，4℃、500-1000g、10 min，收集细胞，弃上清。
3. 用预冷的IP Lysis/WashBuffer重悬细胞。每 1mg 细胞使用5-10μL IPLysis/Wash Buffer。同时加入PMSF等相应的抑制剂，混匀后置于冰上静置5-20 min（期间混匀几次）。
4. 4 ℃,12000 -16000 g,10 min离心收集上清液，置于冰上以备后续实验（或置于-80℃长期保存）。
血清样品：
一般建议建议用IP Lysis/Wash Buffer稀释血清样品至目标蛋白终浓度为50~150µg/mL，置于冰上备用（或置于-20 ℃长期保存）。
免疫复合物的制备
注意：样品所需的量和孵育时间均依赖于每个特定的抗体-抗原体系，因而可能需要优化才能得到最大产量。
以下实验方案针对2-10μg 亲和纯化的抗体，根据需要可以按比例放大。
1. 在离心管中，将每个样品的细胞裂解液与2-10μg 免疫沉淀抗体结合。每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为500-1500μg。
2. 用IP Lysis/Wash Buffer将抗体以及制备好的样品稀释至300-500μL。
3. 在室温下孵育1-2 h，或4 ℃过夜，以形成免疫复合物。
免疫沉淀：
注意：为保证磁珠均匀分布，使用前通过反复颠倒或轻微涡旋混匀瓶中磁珠。
1. 将25 µL (0.25 mg) Biolinkedin®Protein A/G Magnetic Beads加入1.5 mL 离心管中。
2. 向磁珠中加入500 µL 预冷PBS，轻柔混匀。
3. 将离心管放入磁力架中收集磁珠到离心管的一边。去除上清。
4. 向离心管中加入200-500 µL IPLysis/Wash Buffer。颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min。用磁力架收集磁珠。去除上清。
5. 将抗原样品/抗体混合物加入装有磁珠的离心管中，保持混匀室温下孵育1-2 h。
6. 用磁力架收集磁珠，除去未结合的样品，保存以备分析。
7. 向离心管中加入500 µL IP Lysis/WashBuffer，轻柔混匀。收集磁珠，弃上清。再重复洗两次。
8. 低 pH洗脱：向离心管中加入100 µL ElutionBuffer。保持混匀在室温下孵育离心管5-10 min。通过磁力分离磁珠，保留含有目的抗原的上清。每100 µL 洗出液中加入10 µL NeutralizationBuffer来中和低pH。
9. 变性洗脱：向离心管中加入80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1x），将样品置于100℃水浴或者金属浴中加热10 min。通过磁力架分离磁珠，保留含有目的抗原的上清。
注意事项
1. 进行实验操作之前，请务必认真阅读本操作说明书。
2. 请勿高速离心、干燥或冷冻磁珠，这些操作会导致磁珠聚集而降低结合能力。
3. IP实验中不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的，抗体与抗原结合还会受到IP Lysis/Wash Buffer的影响，因此，如使用本试剂盒不能获得最佳的实验结果，可自行优化操作细节或者筛选及配制缓冲液进行实验。
4. 微球使用前应充分振荡均匀。微球应保存在储存溶液中，防止干燥。
5. 本产品仅供研究使用。
6. 低温运输：IP Lysis/Wash Buffer、Elution Buffer、Neutralization Buffer于4 ℃保存，PMSF、Phosphataseinhibitor cocktail、SDS-PAGE SampleLoading Buffer 于-20 ℃保存。
问题解决
1. 抗原没有免疫沉淀下来
a) 样品中所含的抗原过少，不足以被检测
建议：通过 SDS-PAGE 或蛋白免疫印迹验证裂解液中蛋白的表达和/或裂解效率； 如果需要，加大样品量
b) 抗体无法结合抗原
建议：选择另一种特异性抗体，或者选择另一种识别不同抗原表位的抗体。
c) IPLysis/Wash Buffer中的成分干扰了抗原与抗体的结合
建议：使用其它缓冲液进行免疫沉淀和漂洗（例如，含有 0.5% CHAPS的TBS）
2. 获得的蛋白量低
a) 蛋白质被降解
建议：加入蛋白酶抑制剂
b) 所使用的磁珠量不够
建议：提高捕获免疫复合物所使用的磁珠量
c) 样品中的目标蛋白量不够
建议：提高抗原样品量
3. 多条非特异条带
有非特异性的蛋白结合在磁珠上
建议：在IP Lysis/Wash Buffer中加入 50-350 mM NaCl。加大洗脱力度和次数。
4. 磁珠聚集
磁珠在低pH的Elution Buffer中发生聚集属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。
建议：用IP Lysis/Wash Buffer至中性，然后用含有 0.1% （v/v）Tween-20 的 Trisbuffer（pH7.5）振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。也可添加终浓度为 0.1%（v/v）的非离子型去垢剂（如Tween-20或Triton X-100）可有效防止磁珠聚集。
注意：超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落，所以磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法。
5. 磁珠易粘附管壁
建议：使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。
资料下载
Basic IP/Co-IP Kit说明书
