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GST-Tag 蛋白纯化试剂盒(磁珠法)
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GST-Tag 蛋白纯化试剂盒(磁珠法)
货号: PK-2004
规格:
价格: ¥ 1999
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产品描述

Biolinkedin®GST-Tag蛋白纯化试剂盒是GST蛋白纯化琼脂糖磁珠,经过优化预制的缓冲液以及15mL或50mL的磁力架组成,用于高效、快速纯化GST融合蛋白,具有简单,高效,纯度高,省事等特点。

产品组成

GST蛋白纯化琼脂糖磁珠

10mL(20% V/V)

10X结合/洗涤液

50 mL

洗脱缓冲液(待添加GSH)

50 mL

还原型谷胱甘肽GSH

184 mg/

蛋白快速染色液

         50 mL

SDS-PAGE Sample Loading   buffer (5×)

         10 mL

磁力架

50mL双排四孔

注:1. 使用前配制1X结合/洗涤液:按照9:1的比例混合适量结合/洗涤液,例如9mL超纯水和1mL10X结合/洗涤液混合,混合后的溶液即为1X结合/洗涤液缓冲液。

    2.10XGSH溶液和洗脱缓冲液的配制

a. 10XGSH溶液的配制:将试剂盒提供的184mg GSH用6mL本试剂盒提供的洗脱缓冲液(需添加GSH)溶解并混匀,即为10XGSH溶液。配制好的10XGSH溶液-20℃保存,至少一年有效。

b. 洗脱缓冲液的配制:按照9:1的比例混合适量洗脱缓冲液(待添加GSH)和10XGSH溶液,例如9mL洗脱缓冲液(待添加GSH)和1mL 10XGSH溶液混合,混合后的溶液即为洗脱缓冲液。由于GSH在溶液中容易被氧化而失效,洗脱缓冲液宜新鲜配制,配制好的洗脱缓冲液4℃保存,两周内有效。洗脱缓冲液的组分为50mM Tris, 10mM GSH, pH8.0.

纯化步骤

1.    样品准备

以大肠杆菌表达系统为例

1). 4℃离心30 min(4000 g)收集菌体,弃上清。

2). 用预冷1×PBS 重悬细胞, 如果需要,可加入适量的添加剂,如非离子去污剂(NP-40)或蛋白酶抑制剂(PMSF)等。

3). 用超声波破碎法在冰上破碎菌体,直到样品破碎完全。

4) 4℃离心20 min12,000 g),除菌过滤,并小心将上清和沉淀分离,然后用SDS-PAGE分析GST 融合蛋白的含量及可溶性

2. 磁珠预处理

(1) GST蛋白纯化琼脂糖磁珠置于漩涡混匀器上充分混匀,用移液器取适量磁珠悬液于离心管中;

(2) 将离心管置于磁力架上,待溶液变澄清后,移去上清液;

(3) 加入等体积的结合/洗涤液到上述装有磁珠的离心管中,盖紧盖子,漩涡振荡 30s,使磁珠重新悬浮。将离心管置于磁力架上,磁性分离,移去上清液,重复洗涤 2 次。

3.   纯化重组GST融合蛋白

3.1 目的蛋白与磁珠结合

1). 将粗蛋白样品加入到装有预处理磁珠中;

2) 将上述离心管置于漩涡混匀器振荡15s,然后置于旋转混合仪上,2~8℃的低温环境下旋转混合20~30 min,如果需要可延长至2 h或过夜。

3) 将离心管置于磁力架上进行磁性分离,移出上清液到新的离心管中以备后续检测。从磁力架上取下离心管进行后续

4. 洗涤步骤。

4.1 磁珠洗涤

1) 加入1-2倍磁珠体积的结合/洗涤液到装有磁珠的离心管中,旋转混合2 min,磁性分离,移出清洗液到新的离心管中,以备取样检测;

2) 重复上述步骤,3-5次。

4.2 蛋白洗脱

1). 加入适量的洗脱缓冲液于离心管中,然后将离心管置于旋转混合仪上,室温旋转混合30 min(如果需要可延长时间), 磁性分离,收集洗脱液到新的离心管中,即为纯化的目标蛋白样品

2) 分别吸取20-50μl GST 融合蛋白原液、分离液,洗涤液和洗脱液,通过SDS-PAGE电泳分析各样品,确认是否存在蛋白

3). 洗脱液可以通过4℃透析或者分子筛去除游离的谷胱甘肽.。

4.3 蛋白检测

1)SDS-PAGE检测纯化效果,将PAGE胶取下放入塑料器皿中,加入适量蛋白快速染色液覆盖PAGE胶, 然后至于摇床上摇动,染色时间0.5 h-2 h或过夜均可。

2)染色结束后,PAGE胶放置于水中保存并拍照。

5.   磁珠清洗及储存

将装有磁珠的离心管中加入1mL 洗脱缓冲液,用移液器反复吹打3-5次,使磁珠重复悬浮,然后置于磁力架,磁性分离,弃上清,重复该操作2次。向离心管中加入1mL去离子水,用移液器反复吹打3-5次,使磁珠重复悬浮,然后置于磁力架,磁性分离,弃上清,重复该操作2次。最后加入20%乙醇中,使总体积等于初始悬浮液体积,置于 2-8°C 保存。



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G‍ST-Tag 蛋白纯化试剂盒说明书‍‍‍‍‍


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