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His-Tag 蛋白纯化试剂盒(磁珠法)
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His-Tag 蛋白纯化试剂盒(磁珠法)

货号 PK-2003
规格
价格 ¥ 1999
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产品描述

Biolinkedin® His-Tag 蛋白纯化试剂盒是由His蛋白纯化琼脂糖磁珠,经过优化预制的缓冲液以及50mL的磁力架组成,用于纯化各种表达系统融合表达的His重组蛋白。

产品组成

His蛋白纯化琼脂糖磁珠

10mL(20% V/V)

结合/平衡缓冲液

100 mL

洗涤液

100 mL

洗脱缓冲液

100 mL

蛋白快速染色液

50 mL

SDS-PAGE Sample Loading   buffer (5×)

10 mL

磁力架

50mL双排四孔

纯化步骤

1.样品准备

以大肠杆菌表达系统为例

1). 4℃离心30 min(4000 g)收集菌体,弃上清。

2). 用冷结合/平衡缓冲液重悬细胞, 如果需要,可加入适量的抑制剂,如蛋白酶抑制剂(PMSF)或其他蛋白酶抑制剂等。

注意:加入的抑制剂不能对His蛋白纯化琼脂糖磁珠的性能有影响,破碎液中不能含有EDTA、EGTA 等螯合剂,DTT、巯基乙醇等还原剂,尿素、盐酸胍等变性剂。

3). 用超声波破碎法在冰上破碎菌体,直到样品破碎完全。

可选:如果裂解物太粘稠,可以加入RNase A(终浓度10 μg/mL)和DNase I(终浓度5 μg/mL)并在冰上孵育10-15 min。

4) 4℃离心20 min12,000 g),除菌过滤,并小心将上清和沉淀分离。

5).SDS-PAGE 分析His融合蛋白的含量及可溶性。

2. 纯化重组His融合蛋白

1). His蛋白纯化琼脂糖磁珠充分混匀,使用移液器取适量的磁珠悬浮液,置于离心管中,磁性分离,弃上清。

2). 加入与上述磁珠悬浮液等体积的结合/平衡缓冲液,使用移液器反复吹打5-10次,磁性分离,弃上清,重复洗涤2次。

3). 将制备好的含有His 融合蛋白澄清菌液加入到处理好的磁珠中,颠倒混匀。将离心管置于混匀仪上,室温孵育30min。(也可置于2-8℃孵育1h或者过夜)

4). 结合结束后,将离心管置于磁力架上,磁性分离,弃上清(保留,以备检测)。向离心管中加入2-5倍悬浮液体积的洗涤液,移液器反复吹打5-10次,然后磁性分离,用移液器吸取上清(保留,以备取样检测)。重复上述步骤3次。

5). 洗脱蛋白时可根据需要调整洗脱体积从而调整蛋白浓度的目的。建议用2-5 倍柱体积的洗脱缓冲液加入到离心管中,移液器轻轻吹打3-5次,混匀,磁性分离,然后用移液器吸取上清液,即为目的蛋白。如有需要,可以重复上述步骤1次,以提高蛋白回收量。

6). SDS-PAGE检测纯化效果,将PAGE胶取下放入塑料器皿中,加入适量蛋白快速染色液覆盖PAGE胶, 然后至于摇床上摇动,染色时间0.5h-2h或过夜均可。

7)染色结束后,PAGE胶放置于水中保存并拍照。

4.   磁珠再生

将装有磁珠的离心管中加入1mL 洗脱缓冲液,用移液器反复吹打3-5次,使磁珠重复悬浮,然后置于磁力架,磁性分离,弃上清,重复该操作2次。向离心管中加入1mL去离子水,用移液器反复吹打3-5次,使磁珠重复悬浮,然后置于磁力架,磁性分离,弃上清,重复该操作2次。最后加入20%乙醇中,使总体积等于初始悬浮液体积,置于 2-8°C 保存。



资料下载

His-Tag 蛋白纯化试剂盒说明书‍‍‍‍‍




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